连接物 PCR

连接物PCR，是用特定的 DNA序列连接DNA片段，从而达到扩增整个基因组的目的的方法。

连接物PCR的基本原理是由于适于PCR扩增和CGH分析的DNA片段最适长度为0. 2~2.0kb, 因此将基因组DNA 用识别四位点的限制性内切酶(如MseI , 识别TTAA)酶切，产生100〜1500bp的DNA片段， 并在片段的两端连接特定性的DNA序列(adaptor), 并以与该序列互补的DNA序列作为引物扩 增修饰的DNA片段，从而达到扩增整个基因组的目的。

器材：PCR仪。

试剂：

①A45B/B3单克隆抗体(Micromet, Martinsried, Germany)

②荧光标记的羊抗鼠多抗(The Jackson Laboratory)

③Pick 缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl pH8. 3, 75 mmol/L KC1, 3 mmol/ L MgCl2, 137 mmol/L NaCl)

④蛋白酶 K 消化缓冲液(10 mmol/L Tris-acet&te pH7.5, l0 mmol/L MgAc2, 50 mmol/L KAc

⑤0.67% 吐温-20, 0. 67%Igepal, 0. 67 mg/ml 蛋白酶 K)

⑥One-Phor-All- Buffer-Plus 缓冲液(Pharmacia)

⑦限制性内切酶 Mse I (New England Biolabs)

⑧T4 DNA 连接酶 (Boehringer Mannhein)

⑨10 X PCR 缓冲液(Boehringer Mannhein, Expand Long Template, 缓冲液1)

⑩Taq及Pwo DNA聚合酶。

连接物PCR的基本过程可分为如下几步：

(1) 基因组DNA的制备及酶切： 从骨髓抽吸细胞分离单个核细胞，经0.05% 的多聚甲醛固 定后用A45B/B3单克隆抗体和荧光标记的羊抗鼠多抗对肿瘤细胞进行标记，经显微操作分离荧 光细胞，置于含1μl Pick缓冲液的PCR管，加入2μl的蛋白酶K消化缓冲液，42C 孵育 10 h, 80°C处理 lOmin 使蛋白酶 K 灭活，然后加入 0. 2μl One-Phor-All-Buffer-Plus 缓冲液，0. 5 U Mse I 和 1.3μl H2O2, 37°C 消化 3 h。

(2)引物和 adaptor： MseLig21 引物(5『-AGTGGGATTCCGCATGCTAGT-3『)，MseLigl2 引物(5』-TAACTAGCATGC-3』), 分别溶于引物稀释液(Metabion Martinsried, Germany)使终 浓度为l00μmol/L, 两种引物一起退火可作为adaptor, MseLig21引物可作为PCR引物。

(3)DNA片段与adaptor连接： 在上述制备的基因组DNA中加入MseLig21和MseLigl2引 物溶液各0.5μl，再加入1.5μl去离子水、0. 5ptl One-Phor-All-缓冲液，从65°C孵育10 min (引物 变性，同时灭活内切酶)后逐渐降温至15°C复性 (降温速度1°C/1 min)。然后加入ATP (10 mmol/L)1μl, T4 DNA 连接酶 1μl (5U), 16°C过夜连接。

(4)LA-PCR扩增： 在上述反应体系中，加10XPCR缓冲液3μl、10 mmol/L dNTPs 2μl、去 离子水35μl。68C变性4 min, 去除MseLigl2引物，接着加入 1μl Taq和 Pwo 聚合酶混合物 (3.5U), 孵育 3 min后进行如下循环：94°C 40s -> 57°C 30s -> 68°C (lmin 15s), 14 个循环；94°C 40s -> 57°C 30s -> 68°C (lmin 45s), 34 个循环；94°C 40s->57°C 30s->68°C5 min, 反应结束。

LA-PCR扩增的效率较高，不受产物长短的影响，而且扩增产物的序列选择性偏移较少，但 是扩增前的操作繁琐，在单细胞操作时可能丢失部分基因组DNA。