肝炎病毒的病毒分离与鉴定

肝炎病毒是指一组主要侵犯肝脏引起病毒性肝炎的病原体，其中有些也可引起脑、肺和心脏的损害。病原学来源不同的肝炎其实验室检测差异较大，病原学诊断主要涉及甲、乙、丙、丁、戊五型，包括各种肝炎病毒的核酸定性及定量，抗原组分及抗体等三个层次的检测，检查的目的是明确肝炎病因及病毒核酸复制的情况，以协助临床诊断和治疗、流行病学调查以及环境监测。

目以 HAV 和 HBV 感染为例，HAV 感染的实验室检测主要包括三个方面：① 在潜伏期或急性期检查粪便中的甲型肝炎病毒抗原，因为量少且持续时间短，实际很少应用；② 检测发病早期和恢复期双份血清中的抗 HAV 抗体；③ 检测单份血清中抗 HAV IgM 抗体，以区别急性感染与既往感染。

HBV 感染的实验室检测主要包括四个方面：生物化学检测，HBV 血清标志物检测、HBV 分子生物学诊断以及 HBV 临床药物疗效检测。HBV 病原学诊断主要依据 HBV 血清标志物作出判断，包括病毒的抗原抗体及病毒的核酸两方面。

肝炎病毒体外培养十分困难。尽管 HBV 可以在健康成人或人胚胎干细胞中生长，这一培养系统不能用于感染性病毒颗粒的增殖。因此，该系统不能用于实验室的诊断检测。HCV 病毒培养还处于研究阶段。肝炎病毒的细胞培养模型应用性不强，而且因为病毒往往生长缓慢，目前仅用于实验室研究。

器材：黑猩猩、土拨鼠、北京鸭

（一）病毒分离培养

目前动物模型主要用于肝炎病毒的病原学研究、疫苗免疫效果评价及药物筛选等。

1，实验动物 HAV 的主要自然宿主为人类及灵长类动物。黑猩猩、猕猴、狭猴、恒河猴等均对 HAV 易感，我国学者毛江森等还最早建立了短尾猴 HAV 感染动物模型。口服或静脉注射病毒均可使这些动物感染 HAV，并有肝炎症状的表现，粪便中出现完整的有感染性的病毒颗粒，同时被感染动物血液中可查出抗 HAV 的抗体。

对 HBV 敏感的动物有树颐以及黑猩猩、长臂猿和绒毛猴等高等灵长类动物，其中黑猩猩是研究 HBV 的最佳动物模型，但由于道德，经济及饲养操作不方便等原因，使高等灵长类动物模型的使用受到了限制。人 HBV 感染树嗣出现各种临床表现和病毒复制的特征，肝细胞可出现病毒复制并分泌 HBsAg 和 HBeAg，并可发展肝细胞癌。嗜肝 DNA 病毒科的其他成员如鸭乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus，DHBV），土拨鼠肝炎病毒（ wood chuck hepatitisvirus， WHV）及地松鼠肝炎病毒（ground squirrel hepatitis virus ，GSHV）等可在其相应的天然宿主中形成类似人类乙型肝炎的感染，因此可用这些动物作为实验动物模型。家鸭有很高的 DHBV 感染率，已广泛用作嗜肝 DNA 病毒的动物模型，我国常用 DHBV 感染模型进行抗病毒药物筛选以及免疫耐受机制的研究；WHV 在宿主土拨鼠体内引起的病毒生物学效应与 HBV 类似，因而土拨鼠是适于进行病毒复制。细胞感染及癌变机制，抗病毒治疗等研究的实验动物模型。另外， HBsAg 和 HBeAg 转基因小鼠是用 HBsAg 和 HBeAg 编码相应基因制备的转基因小鼠，可为研究 HBV 疫苗及肝细胞癌的病毒性起源提供手段。HCV 最理想的动物模型是黑猩猩，病毒可在其体内连续传代，但症状较轻。对 HDV 敏感的动物有黑猩猩、土拨鼠和北京鸭，可作为 HDV 研究的动物模型。黑猩猩对 HEV 也很敏感。

2．细胞培养 HAV 可在多种原代及传代细胞中增殖，包括原代械猴肝细胞、传代恒河猴胚肾细胞（FRhk4、FRhk6）、非洲绿猴肾细胞（Vero）、人成纤维细胞（2BS）、人胚肺二倍体细胞（MRC5 或 KMB17）及人肝癌细胞（PLC/PRF/S）等。1979 年 Provost 首次利用传代恒河猴肾细胞（FRhk6）成功培养出 HAV。在 HAV 感染的潜伏期末期和急性期早期，可以采取咽拭子或粪便上清液接种敏感细胞进行病毒分离培养和鉴定。目前用于 HAV 分离培养的细胞株主要有 FRhk4 和 2BS，HAV 在培养细胞中增殖速度非常缓慢且不引起细胞病变，病毒经若干代培养后，可逐渐适应细胞，但仍需 20 天才能收获到最大量病毒。因此，从临床标本中分离 HAV 常需数周甚至数月，并且需要用免疫学方法检测病毒的抗原成分才能确定是否有病毒在细胞中增殖。

HBV 体外细胞分离培养尚未成功，目前主要采用全基因组，1.2 倍体或 1.3 倍体 HBV DNA 转染肝癌细胞进行 HBV 扩增，被转染的肝癌细胞可表达所有的 HBV 抗原并可进行病毒复制。目前应用较多的人肝癌细胞系有 PIC/PRF/5 细胞系、Hep3B 细胞系。HepG2 细胞系、HepG2.2.15 细胞系。所获得的体系主要用于 HBV 感染机制和药物疗效评价等研究，检验价值不高。HCV 体外复制细胞培养系统 JFH-1/HCVec 由 2 a 型 HCV RNA（JFH-1 株）构建而成，能自我复制并具感染性。HDV 的基因克隆和表达在原核细胞及真核细胞也已获成功，但 HEV 体外细胞培养困难，迄今仍不能在细胞中大量培养。

（二）病毒的鉴定与分型

1. 免疫电镜检查﹐经消化道传播的病毒性肝炎可采用免疫电镜检测患者潜伏期末期和急性期早期粪便、胆汁的 HAV 和 HEV 颗粒，还可用 RIA 或 ELISA 法检测肝组织中的相应病毒抗原。但这些方法操作较复杂，需特殊设备和技术，且由于病毒在肝组织。胆汁和粪便中存在时间往往较短，阳性率较低，不宜作为常规检查。

检测方法：将含 HAV 或 HEV 的细胞提取液 10 000 r/min 离心 30 分钟，取上清，然后 38 000 r/min 离心 4 小时，沉淀重悬加 1:20 稀释的抗 HAV 特异血清，37 ℃中和 1 小时，28 ℃过夜，2500 r/min 离心 2 小时，沉淀重悬后滴网，磷钨酸负染后镜检。结果判定：可观察到成堆实心和空心颗粒，颗粒间有抗体桥形成，根据颗粒的直径大小，判断 HAV 或 HEV 的感染。

2. 中和试验﹑中和试验可用于 HAV 分离株的鉴定。试验方法：用已知含 320~1 000 log TCID50/ml 病毒悬液与等量的 1:10 稀释的抗 HAV 特异血清混合，37 ℃中和 1 小时，接种单层细胞，培养 28~32 天收样，抽提病毒液，用酶标法检测 HAV 抗原。同时用 HAV 抗体阴性血清作对照，并设不加血清的病毒对照。结果判定：若分离株能被抗 HAV 血清中和，HAV 抗原检测为阴性，而抗 HAV 阴性血清对照和病毒对照结果一致，表明分离株为 HAV。

3. 基于核酸检测的方法

（1）HAV RNA 的检测：HAV 核酸检测应用 cDNA-RNA 核酸杂交技术及 RT-PCR 技术检测标本中 HAV RNA。PCR 引物主要是依据 5'NCR 中的保守序列设计合成。利用 RT-PCR 检测 HAV RNA，敏感，快速，一般 4~12 小时即可得出结果，可以早期诊断 HAV，以便采取有效预防措施，尽早隔离传染源，在防止甲肝流行方面有着重要意义。

由于 HAV-cDNA 克隆成功，应用分子杂交技术检测感染细胞和患者粪便中的 HAVRNA，用 P 标记 HAV-cDNA 片段作探针，与载体上被检标本中的 HAV RNA 杂交，可用于 HAV RNA 的检测。

对于牡蛎等贝类产品中富集的 HAV 可使用硅胶膜柱法提取 RNA，然后进行 RT-PCR，并结合 Southern 杂交法进行 HAV 检测和鉴定。

（2）HBV DNA 的检测

1）用于 HBV DNA 检测的 PCR 主要有巢式 PCR，半巢式 PCR，多重 PCR、原位 PCR 及近年发展的实时荧光定量 PCR 等。这些类型的 PCR 灵敏度和特异性高，可用于检测无血清学标志甚至常规 PCR 检查阴性的 HBV 感染者。但由于检测条件要求较严格，应在具备条件的实验室根据需要选用。PCR 检测 HBV DNA 是一种敏感度很高的方法，因此，实验过程中控制污染是检测中的重要问题，应予以足够重视。

2）核酸杂交检测 HBV DNA 的方法有斑点杂交法、原位杂交法，核酸印迹杂交法等。① 斑点杂交法：本法简便。微量，特异性和敏感性均较高，已被广泛用作药物疗效考核和人群筛检，适用于大量标本的检测。② 核酸印迹杂交法：即用标记探针与经琼脂糖电泳分离并转印到硝酸纤维素膜上的标本进行杂交的方法。如检测 HBV 的 DNA 杂交法，该法较斑点杂交法敏感度高，可将特异性 DNA 片段集中于一条区带上，起到浓缩和纯化作用，可检测肝组织等样本中的 HBV DNA，特异性高。结果判定：杂交带的分子量在 3.2kb 的，为游离型 HBVDNA；大于 3.2kb 者为整合型 HBV DNA。若出现许多弥散状小于 3.2kb 的杂交带，可认为 HBV DNA 为复制状态；出现单一或几个大于 3.2kb 的杂交带，证明为非复制型。对同一标本，整合型与非整合型、复制型与非复制型的 DNA 可同时存在。③ 原位杂交法：具有高度的敏感性和特异性，而且由于不经核酸提取，其特异核酸不会因稀释而导致阴性结果，更重要的是该法能在不破坏组织细胞结构的情况下精细地对待测 HBV DNA 进行定位和定量。肝组织的原位杂交可在冰冻切片或石蜡切片上进行，切片经一定处理后再与探针杂交，后显影观察结果。结果判定：在细胞核、胞质、胞膜及细胞间隙出现颗粒状显色者为 HBV DNA 阳性。

4） HBV 基因分型检测：常用 HBV 基因分型方法如下：① 序列测定法：最直接，可信度高，但烦琐费时而且价格昂贵，对混合型感染检测能力差，不适于大样本检测。② 聚合酶链反应 - 限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）：较测序法简便，适于大样本检测，但由于需要进行酶切，所以操作仍较为烦琐，成本较高，并存在酶切不彻底等问题。③ PreS2 单克隆抗体酶联免疫测定（mAbs EIA 法）：简单，快速，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高，并不能有效鉴别有些混合型感染和 HBsAg 低表达及某些表位表达不充分的标本。④ 分子探针杂交法：简单，快速，对混合型检测非常敏感，目前已经商品化。适于大样本检测，但检测费用较高而且灵敏度和特异度还有待提高。⑤ 型特异性引物 PCR 法：简单，快速，成本低，具有较高的灵敏度，适于流行病学研究和临床大样本检测，但特异性还有待提高。

（3 ）HCV RNA 的检测：主要包括 HCV RNA 检测和基因分型。

1） HCV RNA 检测：检测肝组织内 HCV RNA 可采用原位斑点核酸杂交法，而血清中 HCV RNA 含量较低，多采用较灵敏的荧光 PCR 和 PCR-ELISA 方法，PCR 引物多选用最保守的 5'NCR 序列。荧光定量 PCR 仪定量检测标本中的 RNA 拷贝数，可对丙型肝炎患者干扰素治疗的疗效进行评估。

患者感染 HCV 后 1~3 周，外周血清中即可检测出 HCV RNA，HCV RNA 出现早于 HCV 抗体，HCV RNA 持续 6 个月以上阳性即为慢性感染。

2） HCV 的基因分型：基因分型对于丙型肝炎流行病学的研究具有重要作用，同时有助于对治疗应答情况的预测和疗程的优化。目前对 HCV 的基因分型可通过核苷酸测序分析、PCR-RFLP 和型特异探针杂交等方法对 HCV 5'NCR 和其相邻的核心区进行分析。PCR 检测也用于评价和分析 HCV RNA 基因变异的程度。5'NCR 的分析主要用于型的鉴别，核心区的分析主要用于亚型的鉴别。HCV 核心区同源率若大于 94% ，为同一亚型；介于 89% 和 94% e 之间为同一型的不同亚型；同源率小于 89% 为不同型。

（4）HDV RNA 的检测：HDV RNA 检测主要通过斑点杂交和 PCR 法进行。

（5）HEV RNA 的检测：应用 RT-PCR 可在患者暴露于病原后第 3~7 周时血清中查到 HEV RNA 的存在，也可检测粪便或胆汁中的 HEV RNA，有助于确诊戊型肝炎。

① HBV DNA 检测可了解 HBV 的复制状况，作为确诊病情的主要依据。如 HBV DNA 测定值>1 000 copies/ml，提示 HBV 有复制，而且病毒 DNA 拷贝数的高低与病毒复制的程度成正相关。拷贝数越高，提示病毒复制越活跃，传染性越强；若结果阴性，则表明病毒处于不活跃阶段，病情比较平稳。

② HBV DNA 是目前判断乙肝抗病毒药物用药指征及判断药物疗效最敏感的指标。乙肝抗病毒治疗的标准就是 HBV DNA>1 000 copies/ml，且患者转氨酶超过正常值两倍，此时是肝病患者抗病毒治疗的最佳时机。HBVDNA 阳性者，即使肝功能正常，必要时也应考虑进行抗病毒治疗。HBV DNA 检查结果还可以在一定程度上辅助判断 HBV 是否产生了变异，如在治疗过程中 HBV DNA 检测结果由阴性转为阳性时，提示病毒已发生变异，应结合具体病情重新选择抗病毒药物。