血凝抑制试验（基本方法一）
简介
红细胞凝集抑制试验简称血凝抑制试验，血凝抑制试验最初在 1942 年由 Hirst 提出，1944 年被 Salk 改进，现在是世界卫生组织（WHO）推荐使用的微量测定法。
原理
血凝抑制试验的基本原理是流感病毒能引起红细胞凝集主要是由于流感病毒表面的血凝素与红细胞表面的受体结合，病毒被吸附到红细胞上而产生的。但这一过程可被某些物质所抑制。如血清中血凝素抗体能够与病毒血凝素分子的抗原位点特异性结合，干扰病毒血凝素与红细胞上受体的结合过程，从而抑制红细胞凝集。
材料与仪器
器材：
①一次性无菌手套
②培养箱
③注射器
④细菌滤器
试剂：
①病毒分离物
②标准抗原
③患者急性期和恢复期的双份血清、标准抗血清（包括流感病毒甲 1、甲 3 和乙型流感代表株等）
④霍乱弧菌受体破坏酶（RDE）
⑤鸡红细胞
步骤
血凝抑制试验的基本过程可分为如下几步（微量法）：
（1）血清中非特异性抑制素的去除：在测定之前所用血清必须经 RDE 处理，以去除非特异性血凝抑制素。因为人和动物血清中存在非特异性血凝抑制素是与红细胞表面受体相似的黏蛋白，可与病毒血凝素分子上的受体结合，竞争性抑制病毒与红细胞受体结合。具体的操作如下：
1）按 3：1 的比例将 RDE 和血清（0.9 ml RDE＋0.3 mL 血清）混合；
2）在 37 ℃ 水浴箱中过夜；
3）56 ℃ 水浴 30 分钟，以灭活剩余的 RDE；
4）将上述经 RDE 处理过的血清冷却至室温，加入 1.8 mL 的 PBS 或生理盐水，使血清最终稀释度为 1：10。
（2）血清中非特异性凝集素的测定：经 RDE 处理过的血清可与红细胞发生非特异性的凝集，按下面的方法测定血清中非特异性凝集素是否存在。
1）在 96 孔微量血凝板上除第 1 列外，其余所有孔中均加入 25 μl 生理盐水或 PBS。
2）第 1 列的每一孔中分别加入经 RDE 处理的血清 50 μl。
3）用多道加样器从第 1 列的每一孔吸出 25 μl 加至第 2 列相应的每一孔，并混匀。依次作倍比稀释至第 11 列，混匀后弃去 25 μl。
4）在板上每一孔中加入 25 μl 生理盐水或 PBS。
5）第 12 列各孔作红细胞对照。
6）在板上每一孔中分别加入 50 μl0.5％ 鸡红细胞悬液。
7）混匀后室温（22～25 ℃）静置。如使用鸡或火鸡红细胞，则需要 30 分钟；如使用豚鼠或人「O」型红细胞，则需要 60 分钟。
8）结果确定如果被稀释的抗血清引起红细胞凝集，证明抗血清中存在非特异性凝集素。
（3）血清中非特异性凝集素的去除：如血清中存在非特异性凝集素，可按下面方法去除。
1）用 1 体积的经过洗涤的浓厚压积的红细胞和 20 体积的经 RDE 处理过的血清充分混匀。
2）放置 4 ℃ 1 小时，其间每隔一段时间使沉积红细胞再悬浮、混匀。
3）1200 r／min 离心 10 分钟。
4）吸取上清，注意不要将沉淀的红细胞吸起。
5）重复测定血清中非特异性凝集素是否存在，如果存在，可重复上面的去除方法，直到血清与红细胞不发生非特异性凝集为止。
（4）样品血凝滴度的测定：进行血凝抑制试验之前，应先测定含病毒样品的血凝滴度，然后调制 4 个血凝单位抗原，用于血凝抑制试验。血凝滴度测定的具体方法见前面微量法血凝试验部分。
（5）4 个血凝单位的调制和确认
1）1 个血凝单位指能引起等量红细胞凝集的病毒量。HAI 滴度是基于此测定的。试验中需调制 4 个血凝单位，首先将 HA 滴度除以 8，其商为 8 个血凝单位的稀释度。注意 HAI 试验所需 4 个血凝单位指 25 μl 病毒含 4 个血凝单位，而确定病毒血凝滴度的 HA 试验使用的是 50 μl 体系，所以调制为 50μl 病毒含 8 个血凝单位。
2）4 个血凝单位的再确认：
①在 96 孔微量血凝板中选一行，第 2 至第 6 孔每孔加 50 ul 的 PBS 或生理盐水；
②第 1 孔中加入 100 μl 调制好的含有 8 个血凝单位的病毒稀释液，然后从第一孔中吸出 50 μl 病毒，加入第二孔中混匀后再依次倍比稀释至第 6 孔，最后弃去 50 μl；
③各孔中分别加 0.5％ 鸡红细胞悬液 50 μl，混匀静置 30～60 分钟后观察结果；
④结果的判定：第 1、2、3、4 孔完全凝集，而第 5 孔不凝集，说明该稀释病毒准确，可用于 HAI 试验；如第 5 孔也完全凝集说明该 50μl 病毒含有 16 个血凝单位，需等量稀释病毒后再用；如只有前 3 孔凝集，说明该 50ul 病毒含有 4 个血凝单位，病毒量需加倍后再用。调制好的病毒稀释液应保存于 4℃ 并在当天内使用。
（6）血凝抑制试验操作过程
1）根据所用红细胞种类选择适宜的 96 孔微量血凝板，并做好标记。
2）在 96 孔板第 2 列到第 9 列的每一孔中加入 25μl 生理盐水或 PBS。
3）在第 1 列的每一孔中分别加入 1：10 稀释的经 RDE 处理过的各种血清（包括标准抗血清以及患者急性期和恢复期血清）50μl，在第 11 列的每一孔中分别加入阴性血清 50μl，作阴性血清对照。第 12 列的每一孔中分别加入与第 1 列相同的血清 50μl，作血清对照。
4）用多道加样器从第 1 列的每一孔吸出 25μl 加至第 2 列相应的每一孔，并混匀。依次作倍比稀释至第 8 列，混匀后弃去 25μl。
5）第 9 列各孔用作红细胞对照，第 10 列各孔用作病毒对照（即标准抗原含 4 个血凝单位／25μl）。
6）将 25μl 的标准抗原（4 个血凝单位／25μl）或 25μl 的待检抗原（4 个血凝单位／25μl）加入到 1～8 行血清稀释液中。
7）第 9、10 列每孔中补加 25μl 生理盐水或 PBS。
8）混匀后室温（22～25℃）静置 15 分钟。
9）每孔加 50μl 0.5％ 鸡红血细胞悬液，室温（22～25℃）静置，红细胞悬液的浓度和静置时间根据使用的红细胞种类而定。
10）血凝抑制效价的判定：当特异性抗体与相应血凝素抗原结合后，可抑制病毒引起的血凝现象。血凝抑制效价是完全抑制血凝出现的标准抗血清最高稀释度的倒数。标准抗血清对分离物的抑制效价≥20 才可判断为阳性。如果待检标本的血凝只被某一标准抗血清抑制或被某一标准抗血清抑制的效价高出其他抗血清的 4 倍以上，那么可由此鉴定待测标本的型和亚型。如恢复期血清抗体效价高于急性期血清抗体效价 4 倍以上可确定近期感染。
注意事项
（1）在试验中所用的病毒应灭活，以防传染。
（2）最好每个血凝板上都设有红细胞对照，有利于结果判断，并设血清对照，以便用来检测非特异性凝集是否存在。
（3）标准抗原稀释液必须含有 4 个血凝单位／25 μl，抗原稀释液必须每次试验重新配制和复核。
（4）每个待检抗原和对照抗原必须用阴性对照血清检测。
（5）为得到正确结果，孵育时间必须准确，当红细胞对照完全沉积时，必须马上记录结果。温度也是影响读数的因素，在一定温度下会从红细胞上释放下来，最好将血凝板置 4 ℃ 观察结果。
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