血凝试验和干扰滴定测定病毒滴度
一、简介
某些病毒（如流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、脑炎病毒等）能选择性地凝集个别动物的红细胞，这种现象称为红细胞凝集现象，简称血凝现象，当这些病毒与相应的抗体发生特异性结合后，失去了使红细胞凝集的能力，称为红细胞凝集抑制。红细胞凝集与红细胞凝集抑制试验比补体结合试验操作简单、快速、节约，并且血凝抑制试验具有敏感性高，特异性强的优点。
二、操作方法
血凝试验和干扰滴定测定病毒滴度
三、原理
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四、材料与仪器
0.85% 的无菌生理盐水 阿氏 (Alsever)液 磷酸盐缓冲液 (PBS) 红细胞悬液
96 孔微量血凝板 灭菌注射器 三角烧瓶 离心管
五、步骤
1. 选择适当的 96 孔微量血凝板，如果使用鸡或火鸡红细胞，应选用 V 型微量血凝板；如果使用豚鼠或人"O"型红细胞，应选用 U 型微量血凝板。
2. 除第 1 列外，其它所有孔中均加入 50 µL 生理盐水或 PBS。
3. 在第 1 列的每孔中分别加入 100 µL 待检病毒标本。
4. 用多道加样器从第 1 列的每孔中吸出 50 µL 加至第 2 列相应的每孔，混匀。依次作倍比稀释至第 11 列，混匀后弃去 50 µL。
5. 第 12 列各孔作红细胞对照。
6. 用多道加样器在板中每孔中加入 50 µL 0.5% 的鸡红细胞悬液，注意从第 12 列开始依次加到第 1 列，并注意更换吸头。
7. 混匀后室温 (22℃~25℃) 静止。如使用鸡或火鸡红细胞，则需要 30 min; 如使用豚鼠或人"O"型红细胞，则需要 60 min 。
8. 标本血凝滴度的确定
(1) 血球凝集结果：以"++++，+++，++，+，±，-”来表示；
红细胞均匀地铺于孔底上者为"++++";
红细胞铺于孔底，面积稍小，边缘不整齐者为“+++” ;
红细胞形成一个环状，周围有小凝集块者为“++”;
红细胞形成一个小团，但边缘不整齐有小凝集块者为“+” ;
红细胞于孔底形成一个小团，边缘整齐光滑有立体感，或将血凝板倾斜片刻，可见红细胞滑动如泪滴状则为"-"。
(2) 血凝滴度计算：血凝试验的结果以出现＋＋稀释度的倒数为判定终点，也就是一个血凝单位。它表明此浓度的病毒能引起等量的红细胞发生凝集，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度，简称血凝滴度。理论推算，出现血凝"++"的高一个稀释度应为“-”低一个稀释度应为“++++”（或"+++")。4 个血凝单位计算：将血凝单位除以 4, 例如某标本的血凝滴度为 1 : 640, 则它的四个血凝单位应为： 640/4=160, 即将标本进行 1 : 160 稀释时，其稀释液中含 4 个血凝单位。
六、注意事项
当两种病毒同时感染同一细胞时，可发生一种病毒的增殖抑制了另一种病毒增殖的现象称为干扰现象 (interference) 。有时同种病毒的不同型或不同株之间也可发生干扰现象。对这一现象机制研究首先考虑的是第一种病毒感染后，宿主细胞表面的受体被结合或细胞发生了代谢途径的变化，从而阻止了另一种病毒的吸附、穿入细胞或生物合成。进一步研究发现，经灭活的病毒也具有干扰作用，这就难以用代谢途径变化来解释。以后发现灭活病毒在细胞中可诱导细胞产生抑制病毒复制的一组蛋白质，被称为干扰素 (interferon, IFN) 。干扰素的发现启动了一系列细胞抗病毒作用及病毒免疫的研究。
干扰滴定的原理是将不产生 CPE 的病毒（干扰病毒）先感染细胞，培养一定时间后再用相应的能产生 CPE 的病毒感染同一细胞，继续培养一段时间。如果能产生 CPE 的病毒其形成 CPE受到了抑制，则表明干扰病毒可抑制产生 CPE 病毒的增殖。不产生 CPE 的细胞培养孔即为干扰滴定的阳性孔，计算阳性孔数，用 Karber 法确定干扰病毒的滴度。
七、常见问题
阿氏 (Alsever)液将 20.5 g 葡萄糖、 8.0 g 拧檬酸钠 (Na3C6H5O7·2H20) 、 0.55 g 拧檬酸 (C6 H8O7) 和 4. 2 g NaCl 溶于去离子水并定溶至 1 000 ml(pH7. 1) 。 112℃、 20 min 高压灭菌，4℃备用。
磷酸盐缓冲液 (PBS) 将 8. 5 g NaCl 、 1. 1 g Na2HPO4 和 0. 3 g NaH2PO4 •H20 溶于去离子水并定溶至 1 000 ml(pH 7. 2) 。 121℃ 15 min 高压灭菌， 4℃备用。
红细胞悬液 用10 ml 或 20 ml 灭菌注射器先吸入约 3~5 ml Alsever 氏液，然后从鸡心脏采集鸡血 5~10 ml, 迅速注入盛有 Alsever 氏液的三角烧瓶中，摇匀， Alsever 氏液与鸡血的比例为 4: 1 。使用前吸取红细胞悬液至离心管中，加人 5~10 倍体积的生理盐水洗涤 3 次，前两次2 000 r/min离心 5 min, 最后一次同速离心 10 min 弃上清液，用无菌生理盐水配成 0.5%浓度的红细胞悬液， 4℃备用，不得超过 3 天。如使用豚鼠或人 "O"型红细胞，应该使用 0. 75% 的红细胞悬液。
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