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微生物学

利用双杂交差异互作筛选以分离功能突变体实验

2024-04-23 微生物学加入收藏

材料与仪器酵母菌株Y187 Y190 质粒pDAbl89 pDAb1 PAIP70 PJT20AIP1 PCR 产物YPD SC-trp 平板无菌绒布步骤

材料与仪器

酵母菌株Y187 Y190 质粒pDAbl89 pDAb1 PAIP70 PJT20
AIP1 PCR 产物
YPD SC-trp 平板无菌绒布

步骤

诱变 PCR ljul pDAbl89 (10ng/XDNA) 5jumol/L MCo-AIPl-DBI>1 5^1 5jumol/L MCo-AIPl-DBD-2 5M1 10X T 叫聚合酶缓冲液 5一 2mmol/L dNTP 0. 5jnl BSA 1^1 Tag聚合酶 26. 5^1 H20 标准 PCR反应程序 94〇C 4 min 25个循环： 94〇C lm in 55°C lm in 72〇C 2. 5min 72°C 20min 4°C保持载体准备用 SaZ I 和工酶切消化 p D A b l载体用于酵母菌株Y 190内缺口修复 77. 8jrxl H 20 10|ug pDAbl lO yllO X B a m H I 缓冲液 4：ill Sal I

4jul BamH I ljutl 10 mg/ml BSA 37°C 消化 5h 用等体积的1 : 1 酚-氯仿和乙醇于一 20°C沉淀过夜第 2 天 13 000 r/min 离心 lOmin 8 0 % 乙醇洗涤沉淀烘干沉淀并重悬于8〇 4 TE (pH 8. 0) 第 1 天接种 11-2 (Y190)菌株于5m lY P D 液体培养基， 30°C培养过夜，为第 2 天早晨的缺口修复转化做准备。第 2 天将过夜培养物11-2 (Y 190)菌株转接入50ml YPD，经过至少3 次倍增后，终浓度将达到2X 107 个/m l。这一菌株的倍增时间大概是90m in，我们可以假定如果过夜培养物达到稳定期时每毫升有2X 108〜2. 5X 108个细胞。按照 “技术与方法1，酵母的高效转化” ，做一个不含D N A 的阴性对照转化，一个仅含有ly l 切好的pDAbl D N A 的转化和另外两个含lju l切好的 p D A b l和 5ju lA IP l的 PCR产物的转化。将细胞最终重悬于20(^1无菌水。将阴性对照转化物和仅含p D A b l的转化物全部涂布在两块SC-trp 平板上。分别将 2〇 4和 180M1缺口修复转化物涂布在两块SC-trp 平板上（共四块）。 30°C培养。第 3 天接种菌株 11-3 (Y187+pAIP7 0 ) 和 11-4 (Y187+pJT2 0 ) 于 5mlSC-leu 液体培养基， 30°C培养过夜。第 4 天将 200〜300个从缺口修复转化物平板上长出的单克隆重新有序挑到两块或三块新的 SC-trp 平板上。将 2004 菌株 11-3 (Y 1 87+pAIP7 0 ) 和 11-4 (Y187 + pJT2 0 ) 分别涂布在两块或三块 SOleu平板上，使之形成菌苔。 30°C培养。第 5 天将每块排列好的缺口修复转化物平板影印到两块YPD 平板上。在一块上再影印菌 • 株 11-3 (Y187+pAIP70)的菌苔，另一±夬上再影印菌株11-4 (Y 187 + pJT2 0 ) 的菌苔。一定要记得标记平板的方位， 30°C 培养。将排列好的缺口修复转化物原始板于4°C 保存。

第 6 天将发生接合作用的细胞影印到SC-trp-leu平板上， 30°C培养。第 8 天将发生接合作用的细胞再次影印到SD+ ademine+ 2 5 m m ol/L 3-A T ， 50mmol/L 3- A T 和 lOOmmol/L 3-A T ，并于 30°C培养。第 1 3 天挑出那些在一块含一种接合对的3-A T 平板上长，但在另一块3-A T 平板上不长的克隆，再从原始的缺口修复转化物平板上将这些目标突变体划线至新的SC-trp 平板上以得到单克隆。到这一步实验结束，但是如果想再进一步完善它，则需要将质粒从酵母中拯救到 E.coZ冲（技术和方案3C， lO m in制备酵母DN A; 转化 £.co h 或酵母以释放质粒）。接着我们将通过回转突变体至双杂交测试菌株中以对其重新验证。如果它仍然仅与其中的一个蛋白不能发生相互作用，那么我们将对该突变体进行测序并检测其生物学功能。

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