呼吸道感染病毒标本的直接检测

通过显微镜观察、或者检测病毒的抗原和核酸，可以直接显示病毒的存在。直接检测病毒的方法包括电镜观察病毒颗粒、光镜下观察病毒感染后宿主细胞的特殊改变、免疫荧光检测、酶免疫技术以及病毒核酸检测技术。

器材：

①一次性无菌手套
②标本采集管
③棉签拭子
④电子显微镜
⑤微孔板条
⑥酶标仪
⑦PCR仪

试剂：

①材料：待采标本
②PBS缓冲液
③琼脂

呼吸道感染病毒标本的直接检测的基本步骤可分为如下几种：

（一）显微镜观察

通过在光学显微镜下观察病毒引起的细胞病变，如观察RSV感染形成的合胞体，或者通过荧光抗体染色后，观察荧光阳性细胞，显示病毒的存在。电子显微镜偶尔用来确定标本中呼吸道病毒。通过形态学和与特异性免疫血清的反应初步识别。然而，由于该检测需要专业设备、经验丰富人员和较高的试验成本，以及检测的灵敏度较低，已很少用于呼吸道感染病毒的诊断。

（二）免疫荧光技术

免疫荧光技术（immunofluorescence assay，IFA）是在荧光显微镜下观察细胞内病毒抗原及存在的位置，从而显示病毒的存在，为呼吸道病毒的快速诊断方法之一。应用免疫荧光法检测标本中细胞内的病毒抗原，可在数小时内获得结果，但易产生非特异性染色。检测的方法包括直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验两种。可用免疫荧光技术直接检查呼吸道脱落上皮细胞内病毒特异抗原，呼吸道病毒特异抗原以及病毒培养物中的抗原。

（三）酶免疫技术及其衍生技术

1．检测病毒抗原 酶免疫技术中ELISA由于需要较长的反应时间和几次洗涤过程，只能在实验室中使用，如用ELISA定性检测血清或血浆标本中SARS-CoV N抗原，用于SARS-CoV感染的早期辅助诊断。

目前国内可以供应的商品化呼吸道病毒ELISA 检测试剂盒主要用于甲型、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的检测。基于酶免疫技术发展起来的免疫层析技术（胶体金层析），可在30分钟获得结果，在呼吸道感染病毒的快速筛查中应用更广，现有多种检测流感病毒、呼吸道合胞病毒的试剂盒。这些快速检测方法的灵敏度范围为60％到90％不等。

2．检测病毒抗体 常用ELISA方法检测，检测的抗体可包括IgG、IgM、IgA或总抗体。一般同时检测急性期和恢复期双份血清，效价升高≥4倍具有诊断意义。

（四）病毒核酸检测技术

几乎所有已知的呼吸道感染RNA病毒都能用单重RT-PCR进行检测。由于呼吸道感染病毒种类多，核酸检测倾向于多目标技术，包括多重 RT-PCR、基因芯片技术等，实时荧光定量PCR以及反转录PCR技术在诊断新发传染病以及病毒培养较为困难的病毒毒株时具有非常重要的价值，除商业化销售的试剂盒之外，上级疾病控制部门还可能根据实际需要下发针对特定新发传染病病原体的检测试剂盒。

例如流感大流行期间下发的新甲型H1N1亚型流感病毒检测试剂盒，SARS冠状病毒检测试剂盒以及中东呼吸合征冠状病毒检测试剂盒等。