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微生物学

比色法(淀粉酶的固态发酵实验)

2024-05-09 微生物学 加入收藏
一、简介淀粉酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热,3,5-

一、简介

淀粉酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热,3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。

 二、操作方法

比色法(淀粉酶的固态发酵实验)


 三、原理

淀粉酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。在碱性条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热,3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度呈一定的比例关系,可在722型分光光度计540 nm波长测定棕红色物质的吸光度值。查标准曲线计算,可求出发酵液中还原糖的含量,从而求出淀粉酶活力。

材料与仪器

麸皮 面粉
NaNO3 KH2PO4 (NH4)2SO4 CaCl2 MgSO4·7H2O CoCl2 FeSO4·7H2O ZnSO4
分光光度计 恒温水浴锅 生化培养箱 磁力搅拌器 三角瓶

步骤

一、实验主要仪器设备和材料
分光光度计、恒温水浴锅、生化培养箱、磁力搅拌器、三角瓶、麸皮、面粉、NaNO3 、KH2PO4、(NH4)2SO4、CaCl2、MgSO4.7H2O、CoCl2、FeSO4·7H2O、ZnSO4
二、实验方法、操作步骤
1. 还原糖的测定
(1)标准曲线的制作
取9支干燥试管编号,按表1所示的量,精确浓度为1.00 mg/ml的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。表中单位为ml。

将各管摇匀,盖上小漏斗,在沸水浴中加热5 min,立即用冷水冷却至室温,再向各管中加入蒸馏水至 20.5 ml,用橡皮塞塞住管口,混匀。切勿用力振摇,以免引入气泡。在540 nm波长下,以0号管为空白,在分光光度计上测定1-8号管的吸光度值。以吸光度值为纵坐标,葡萄糖毫克数为横坐标,绘制标准曲线。
表1 还原糖标准曲线制作
(2)发酵液中残留还原糖的测定
发酵液单层滤纸过滤,滤液0.2 ml定容至100 ml,500倍稀释至含糖量2-8 mg/100 ml为试样。
取4支干燥试管,编号,按表2所示的量,精确加入待测液和试剂(ml)
试剂加入后,其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同,测定出各管溶液的吸光度值。
计算
以管1、2、3的吸光度值的平均值在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数,按下式计算样品中还原糖的百分含量:

表2 还原糖的测定


2. 氨基态氮的测定
(1)取发酵滤液5.00 ml,置于100 ml烧杯中,加入15 ml水,磁力搅拌器搅拌5 min后,将电位计插入烧杯中,用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH=8.20,此为游离酸度,不予计量。加入10.0 ml甲醛溶液,立即混匀,迅速用0.1 mol/L NaOH标准溶
液滴定至酸度计指示pH=9.20,计下消耗NaOH标准溶液的毫升数。同时用水做空白实验。
(2)计算
氨基氮(%)=(V-V0)×N×0.014×20/5×100
式中: V--加甲醛后试液消耗氢氧化钠体积,ml;
V0--加甲醛后空白液消耗氢氧化钠体积,ml;
M-- NaOH标准溶液的浓度,mol/L;
0.014--与1.00 ml NaOH标准溶液相当的氮的质量,g;
(3)淀粉酶活力的测定及计算
淀粉酶活力(IU/g干培养基):本实验条件下,每分钟释放出1umol还原糖所需要的酶量称为一个酶活力单位。

(4)总体实验操作流程:
①配制培养基,灭菌,冷却。
②冷却后接种,并搅拌均匀,置于28 ℃培养箱进行培养。
③每隔24 h取样,用0.2 M 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0)按一定的浸提比进行浸提1 h,离心得粗酶液。共取样6次。
④分别测定酶液中淀粉酶活力、还原糖和蛋白质含量。
三、实验结果
1. 以还原糖浓度为纵坐标,培养时间为横坐标,绘出不同时间还原糖的变化曲线。
2. 以氨基态氮浓度为纵坐标,培养时间为横坐标,绘出不同时间氨基态氮的变化曲线。
3. 以淀粉酶活力为纵坐标,培养时间为横坐标,绘出不同时间淀粉酶活力的变化曲线。



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