差异性甲基化杂交(DMH)

1. 微阵列构建 （1）基因组片段化：将雄性个体（雄性个体包括完整的染色体，即含有Y染色体）基因组DNA经MseI消化（MseI识别位点为TTAA，可以保证富含CpG的片段不被破坏）成约200 bp 的小片段，而CpG岛仍然保持相对完整。 （2）去除富含甲基化CpG的高度重复序列：如上所述，在正常组织或细胞中，5 mC 多发生在高度重复序列，使得这些重复序列得以稳定，从而保持异染色质结构。而位于启动子区的CpG大部分是非甲基化的，所以可以使用第一轮结合片段化基因组DNA（实验中多使用MeCP2的MBD结构域，它们可以特异的亲和高甲基化的CpG片段），而去除高甲基化的重复序列片段，低甲基化的启动子CpG片段由于不结合MeCP2而保留在溶液中。 （3）体外酶处理重新使得非甲基化的启动子CpG片段甲基化：在非结合片段中，除了一部分非甲基化的启动子CpG片段（CpG岛）外，还有很多非CpG岛序列，用M．SssI（甲基化CpG中的C为5mC）处理这些片段，可形成甲基化启动子CpG岛片段。 （4）体外重新甲基化的启动子CpG岛片段的分离：将体外重新甲基化的片段再过一次MeCP2亲和柱，即可将启动子CpG岛片段分离出来。 （5）构建CpG岛库（CpGislandlibrary，CGl）：将获得的启动子CpG岛片段连接载体、转化细菌，克隆扩增，即获得CGI文库。1994年Bird等人就用这种方法获得了CGI。

（6）微列阵芯片制备：以CGI库为模板，PCR扩增获得其插入的CpG序列，点样于微列阵芯片上。这种芯片现在已经商业化，有的包含了80%的CpG岛样序列。

2. 样品DNA处理 （1）待测样品基因组片段化：同样经MseII肖化，产生和微阵列相匹配的片段。 （2）连接接头：在片段两头的黏性末端各加上一个接头（1 inker），右斜纹推荐使用H12和H24两个片段。 （3）甲基化敏感的内切酶区分甲基化片段：用甲基化敏感性内切酶BstU Ⅰ/HpaⅡ（因甲基化的C会干扰酶的活性），组合消化去除未甲基化者序列。另外，有些实验使用甲基化依赖的内切酶，结果正好相反，保留了甲基化的序列。

（4）接头―PCR：用PCR扩增正常样品和肿瘤样品中甲基化片段。

3. 微阵列杂交

分别用Cy3和Cy$荧光染料标记正常样品和肿瘤样品的甲基化扩增产物，混合后与CpG岛微阵列杂交，荧光扫描。通过比较荧光颜色判断样品甲基化情况，红色和蓝色分别代表在肿瘤和正常组织中存在甲基化，黄色代表在2种组织中都存在甲基化。

该方法能同时检测正常样本/肿瘤样本中近9000个CpG岛的甲基化状态，并能迅速找出与肿瘤发生相关的CpG位点，在疾病分子生物学分型、药理学等领域有广泛应用前景。而且随着技术的发展，更大容量或小型用于不同目的的芯片正在出现。 该方法对于不含BstU I/HpaⅡ酶切位点的序列将给出正常样本和肿瘤样本中均存在甲基化的假阳性的结果，所以必须对感兴趣杂交点的序列进行进一步验证。此技术目前已经应用于乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌等多种癌症甲基化组的分析。