多重替代扩增

多重替代扩增，是基于链替代扩增方法创建的扩增全基因组的方法。

多重替代扩增的基本原理是链替代扩增 (strand displacement amplification, SDA) 是应用滚环扩增 (rolling cycle amplification, RCA) 的方法，既可用于信号的放大也可用于目的基因的扩增。Dean F. 等基于链替代 扩增方法原理创建了 MDA, 用于扩增全基因组 (见图 13-11)。该方法利用φ29DNA聚合酶和随 机六聚体引物对人基因组进行扩增，可以直接从生物样品如全血、组织培养细胞中扩增，在常温 等温下扩增，避免了高温下 DNA 降解对扩增产物质量的影响。φ29DNA聚合酶具有的主要特性 如下：①具有非常高的向前延伸的活性，且与模板紧密结合，能高效合成 DNA, 每一次结合到 DNA 链上可以引导 70000个碱基掺入。这样随机起始合成有代表性的基因组DNA 不会受序列本 身的碱基组成、短的串联重复序列或二级结构影响，使得在存在复杂的一级和二级结构的情况下 PCR反应仍能顺利进行高效的DNA 合成，最大限度减少了链转换和二级结构形成。②支持链取 代 DNA 合成。下游的互补链被酶取代出来成为单链，并可以作为下一步随机六碱基引物的起始 模板。③φ29DNA聚合酶 3'→ 5'外切酶活性，其有高保真纠错功能，报道的错误率仅为 10-5〜 10-6, 约比 Tg 聚合酶低 100 倍。 所以与 DOP-PCR 和PEP-PCR 比较，MDA 无论是扩增的效 率，还是扩增的可信度都明显优于DOP-PCR和PEP-PCR, 能均匀扩增全基因组，而没有明显的 偏移；MDA 可以从 1〜10个拷贝的基因组DNA 扩增出 20〜30 μg 的产物，DNA 产物的平均长度 大于10kb。 MDA 具有的这些优点使 MDA 适合多方面的应用，包括定量 PCR、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)基因分型、Southern blot 分析及染色体图谱的绘制等。 MDA 不需要从微生物样品中分离基因组DNA 就可直接进行扩增，并可用于DNA序列分析。因 此，MDA 是扩增难以分离培养的生物样品基因组DNA的首选方法；MDA 也可用于从可疑感染 的组织中扩增微生物基因组DNA, 如关节炎。

器材：PCR仪。

试剂：

①基因组 DNA : l00fg—300ng；

②引物：50μmol/L (5』-NpNpNpNpsNps N-3』, 巯基磷酸修饰，核酸外切酶抗性)；

③lmmol/L dNTPs； 10 mmol/L MgCl2 ；

④37 mmol/L Tris-HCl, pH7.5；

⑤50mol/.L KC1；

⑥5 mmol/L (NH4)2SO4;

⑦酵母焦磷酸酶 lU/ml；

⑧φ29DNA 聚合酶 800U。

多重替代扩增的基本过程可分为如下几步：

（一）反应体系： 基因组 DNA : l00fg—300ng；引物：50μmol/L (5』-NpNpNpNpsNps N-3』, 巯基磷酸修饰，核酸外切酶抗性)；lmmol/L dNTPs； 10 mmol/L MgCl2 ； 37 mmol/L Tris-HCl, pH7.5； 50mol/.L KC1； 5 mmol/L (NH4)2SO4; 酵母焦磷酸酶 lU/ml；φ29DNA 聚合酶 800U。

（二）扩增条件 30°C孵育18 h, 扩增结束后 65°C 3 min 灭活。

MDA的扩增效率也决定于模板的质量，不同模板扩增效率差别很大。随着模板 DNA 分子 量的降低，扩增产物的量也下降。因此，该方法对于降解的DNA, 如甲醛固定组织或低分子量 DNA 并不是最理想的选择。