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PCR技术

常规巢式 PCR

2024-05-14 PCR技术 加入收藏
简介常规巢式 PCR 通过两轮 PCR 反应,使用两套引物扩增特异性的 DNA 片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮 PCR 产物内的一段 DNA 片段

简介

常规巢式 PCR 通过两轮 PCR 反应,使用两套引物扩增特异性的 DNA 片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮 PCR 产物内的一段 DNA 片段。

原理

巢式 PCR 的基本原理是是利用第 1 轮 PCR 产物作为第 2 轮 PCR 的模板,除使用第 1 轮的 1 对特异引物之外,在第 2 轮 PCR 反应中,使用 1 对新的特异引物,它们与模板 DNA 的结合位点处于第 1 轮引物扩增出的 DNA 片段内,这样在第 2 轮中错误扩增的可能性极低。

材料与仪器

器材:PCR 扩增仪、电泳仪

试剂:

① 模板: 基因组 DNA 或 cDNA

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

③ 10 umol/L 四条特异引物: 两条外引物,两条内引物

④ TaqDNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液

⑤ 高压灭菌去离子水

步骤

常规巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步:

(一)引物设计

巢式 PCR 的引物设计原则与常规 PCR 相同。通常内引物与外引物间隔多长距离也没有统一的要求,具体情况根据每个实验而定。

(二)巢式 PCR 反应

A. PCR 反应体系:

设立 50 pl 的 PCR 反应体系,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:

10× PCR 缓冲液 5 μl

DNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl) 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 (P1 ,P2) 各 1 μl

H2O 至 50 μl

如果 PCR 仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油 (约 50 μl)。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

B. 设置 PCR 反应条件:

预变性 94 ℃,3 min

变性 94 ℃,30 s

退火 55 ℃,30 s 30 个循环

延伸 72 ℃,60 s

延伸 72 ℃,7 min

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

C. 进行第二轮 PCR 反应,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:

10× PCR 缓冲液 5 μl

cDNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl) 0.5 μl

10 μmol/L 的内引物 (P3 ,P4) 各 1 μl

H2O 至 50 μl

PCR 反应条件同第一轮。

D. PCR 产物的检测

反应结束后,用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。


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