16 SrRNA PCR在临床诊断及流行病调查中的应用

16 SrRNA PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是采用16S rRNA基因克隆文库的方法分析菌群组成已广泛应用于环境和临床微生物中，它既可以分析标本中细菌的种类，又可以反映标本中各种细菌的相对比例，可以相对定量。

16 SrRNA PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是细菌的核糖体RNA (rRNA)按沉降系数分为5S、16S 和23S,其编码基因(rDNA) 长度依次为120个、1540个及3300个核苷酸。

典型的原核生物大肠杆菌核糖体是由50S大亚基和30S小亚基组成的。在完整的核糖体中，rRNA约占2/3,蛋白质约为1/3。50S大亚基含有34种不同的蛋白质和两种RNA分子，相对分子质量大的rRNA的沉降系数为23S,相对分子质量小的rRNA为5S。

30S小亚基含有21种蛋白质和一一个16S的rRNA分子。rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守。rRNA基因包含5'端到3'端的若干种成分，分别是16S rDNA、间区、23SrDNA、间区和5SrDNA。

16SrDNA基因是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，它集保守性和变异性于一身，存在于所有细菌的染色体基因组中。

16 SrRNA PCR可用于细菌的检测、鉴定、监测及系统进化研究。

器材：临床标本DNA/RNA提取试剂盒，细菌基因组提取试剂盒，普通PCR试剂盒，荧光定量PCR试剂盒，反转录PCR试剂盒，PCR产物回收试剂盒，DNA测序仪等。

获得目的16S rDNA有两种方法(见图12-6)。

（一）从基因组直接扩增法

A. 从微生物样品中直接提取总DNA对已知的纯培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。

①细菌培养:将细菌接种于5 ml液体培养基中，37 °C摇床(300 r/min) 培养过夜。
②细菌收集:取1 ml培养物于1.5 mlEP管中，室温8000 r/min离心5 min,弃上清，沉淀重新悬浮于1 ml TE (pH8.0)中(用ddH2O也行)。
③菌体裂解:加入6 μl 50 mg/ml的溶菌酶，37 °C作用2 h。

再加2 mol/L NaCl 50 μl、10% SDS 110 μl、20 mg/ml 的蛋白酶K 3 μl，50 °C作用3 h或37 °C过夜。(此时菌液应为透明黏稠液体)
④抽提:菌液均分到两个1. 5 ml EP管，加等体积的酚~氯仿-异戊醇(25 : 24 : 1)，混匀,室温放置5~ 10 min。

12000 r/min 离心10 min。 抽提两次。(上清很黏稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去)
⑤沉淀:加0. 6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10 min。12000 r/min 离心10 min。
⑥洗涤:沉淀用75% 的乙醇洗涤。
⑦抽(凉)干后，溶于50 μlddH2O中，取2~5 μl电泳。作PCR模板用。

此外也可使用市售细菌基因组DNA提取试剂盒获得较纯的基因组DNA。

B.从医学标本或样品中提取基因组DNA如果提供的材料是医学标本或样品则直接提取基因组DNA而不要培养，此方法如下:
液体标本高速离心(12000 r/min) 10min， 沉淀加50μl“标本预处理液”，37 °C 孵育30 min,12000r/ min离心10 min,沉淀待用;组织标本直接加等量“标本预处理液”，操作同上述。

处理后的标本加入30 μl专用裂解试剂(可购自北京美莱博医学技术有限公司)，振荡仪上振荡5 min,使标本与试剂充分混合，然后煮沸10 min，使标本中的核酸物质彻底释放并溶解在缓冲液中;离心后上清即可进行PCR。

C.PCR扩增rDNA对已知的纯培养的微生物可以设计特异引物，在GenBank搜索同种的菌种的rDNA序列，一般同种的 rDNA序列有99% 以上的-致性。设计好的引物通过BLAST比对验证其特异性。
对医学标本或样品则可设计通用引物扩增目的16S rDNA。

如:
正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
反向引物5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

D.纯化凝胶电泳检测后 可使用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增DNA。

（二）rRNA反转录法

A. 取16SrDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞。对未知序列的rRNA要测序，应该对目的rRNA进行纯化。

B.以同源已知的rRNA序列为模板设计引物，RT-PCR获得c-rDNA再测序。.

C.CDNA的合成。反转录体系共20μl,包括细胞总RNA 2 μg/2μl, 50 U/μl Rnasin 1 μl，5×反转录反应缓冲液4μl，10 mmol/L dNTPs 2μl，50 μg/ml 随机引物2 μl，200 U/μl M-MLV反转录酶1μl, DEPC 8 μl。37 ℃反应60 min，95 °C 5 min终止反应。cDNA 在- 80 °C 保存或进行PCR扩增。

注意事项：如果实验对象是纯培养物，则可以按上述方法获得rDNA后直接测序。对于从样品标本中获得的rDNA,需构建16S rDNA文库，然后挑取单克隆测序。

1.采用PCR技术可以一-次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16SrRNA序列，但也同样会出现PCR所固有的缺点，尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增，可能出现嵌合产物(chimeric product)和扩增偏嗜性现象。

2.采用16SrRNA基因克隆文库的方法分析菌群组成，既可以分析标本中细菌的种类，又可以反映标本中各种细菌的相对比例，可以相对定量。但不是绝对定量，即标本中菌群的比例与克隆文库中对应单克隆的比例相关，但不是直线相关。

3.16SrDNA基因克隆文库不能完全反映标本的真实情况，有些细菌的比例太低，或有的细菌的rDNA不能用通用引物扩增出来而无法在克隆文库中出现。前者可通过加大文库量来解决，后者可通过设计兼并引物和多对引物同时使用部分解决。