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PCR技术

使用增强剂改善高(G+C)含量DNA模板的PCR扩增

2024-05-14 PCR技术 加入收藏
简介许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟(G)和胞啥呢(C)碱基形成氢键,从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键,破坏由 G 和 C 间氢

简介

许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟(G)和胞啥呢(C)碱基形成氢键,从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键,破坏由 G 和 C 间氢键形成的 DNA 分子二级或三级结 构。增强剂不仅可以提高 PCR 产物产量,而且对于提高 PCR 产物的专一性也有帮助,而在扩增 较长片段高(G + C)含量 DNA 模板时,增强剂更是必不可少。

原理

使用增强剂改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟(G)和胞啥呢(C)碱基形成氢键,从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键,破坏由 G 和 C 间氢键形成的 DNA 分子二级或三级结构。增强剂不仅可以提高 PCR 产物产量,而且对于提高 PCR 产物的专一性也有帮助,而在扩增较长片段高(G + C)含量 DNA 模板时,增强剂更是必不可少。至今已有许多增强剂应用于高(G + C)含量 PCR 扩增,包括 DMSO (二甲亚碉)、甲酰胺、甘油、甜菜碱(betaine)、聚乙二 醇(polyethylene glycol, PEG)、7-脱氮-脱氧鸟嗦吟核昔三磷酸(7-deaza dGTP)、脱氧肌昔 (deoxyinosine)以及其它小分子酰胺类(amides)、砚类(sulfones)和亚砚类(sulfoxide)等有机试剂。

材料与仪器

器材:

ToboCycler® Gradient 96 thermal cycler (Stratagene, La Jolla, CA, USA),电泳仪。

试剂:

① dNTP 和 Taq DNA 聚合酶(Stratagene 公司)

② 四亚甲基亚碉 [tetramethylene sulfox¬ide Acros Organics (USA)公司

③ 人骨髓白细胞 mRNA (Clontech)

④ RT-PCR 试剂盒(Strata¬gene 公司)

⑤ 琼脂糖(Promega 公司)

⑥ TAE 电泳缓冲液

⑦ Tris、HC1、KC1、MgCl2,明胶等为分析纯

步骤

使用增强剂改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本过程可分为如下几步,以人骨髓白细胞 mRNA 为例:

A 引物设计根据人骨髓白细胞 ojzm 基因序列设计上下游引物:

c-jun 1:5'-ATGACTGCAAAGATGGAAACG;

c-jun 2:5'-TCAAAATGTTTGCAACTGCTGCG

B 模板制备人骨髓白细胞 ojun cDNA,全长 996 bp,用 RT-PCR 试剂盒(Stratagene 公司)从人骨髓白细胞 mRNA(Clontech)反转录获得。

C 反应体系将下列各种成分加至 200』薄壁管:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.8),50 mmol/L KC1,1.5 mmol/L MgCl2,0.1 g/L 明胶,0.2 μmol/L 引物,0.2 mmol/L dNTP,0.06 ng/μL 模板,0.5 mol/L 四亚甲基亚砚。按 0.04U/μL 加 DNA 聚合酶(模板变性后添加),用水补足至总体积 50 μL。

D 反应条件将薄壁管放入 PCR 仪,升温至 95 ℃ 保持 5 min,以使模板 DNA 完全变性;降温至 54 ℃ 保持 5 min,在此期间按 0.04 U/Ml 添加 Tag DNA 聚合酶;按(95 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min)进行 30 个循环反应;最后,72 ℃ 延伸 5 min。

E PCR 产物检测用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 反应产物。

注意事项

1因不同增强剂对不同模板效果有所差异,用PCR扩增其它高(G+C)含量DNA模板时,如果没有PCR产物,可尝试使用本节所列其它增强剂。

2 PCR循环反应前,先 95 ℃ 变性5 min,一般可以将包括基因组DNA在内的大多数复杂DNA变性,在加四亚甲基亚碉作为变性剂时,变性温度甚至可以降到 92 ℃。

3 Taq DNA聚合酶对高温相对敏感,模板变性后添加Tag DNA聚合酶有利于保护酶的活性。若用Pfu DNA聚合酶,对高温稳定一些。

4 PCR循环扩增时,95℃变性1 min可以使非常复杂的模板变性;若以质粒克隆片段作模板,变性时间甚至可以缩短到30 s。退火温度可根据模板和引物复杂程度,作适当的调整,一般在50〜70℃之间,时间也可以缩短到30 s;延伸温度与使用的DNA聚合酶有关,常见的Pfu、Vent等为72℃,而用Roche公司的Expand Long Template PCR System中DNA聚合酶延伸温度为68℃;延伸时间与模板长度和使用酶的效率有关,可参考相关商品酶使用说明书。

常见问题

1 因不同增强剂对不同模板效果有所差异,用 PCR 扩增其它高(G + C)含量 DNA 模板 时,如果没有 PCR 产物,可尝试使用本节所列其它增强剂。

2 PCR 循环反应前,先 95 ℃ 变性 5 min, 一般可以将包括基因组 DNA 在内的大多数复杂 DNA 变性,在加四亚甲基亚碉作为变性剂时,变性温度甚至可以降到 92 ℃。

3 Taq DNA 聚合酶对高温相对敏感,模板变性后添加 Tag DNA 聚合酶有利于保护酶的活 性。若用 Pfu DNA 聚合酶,对高温稳定一些。

4 PCR 循环扩增时,95 ℃ 变性 1 min 可以使非常复杂的模板变性;若以质粒克隆片段作模板,变性时间甚至可以缩短到 30 s。退火温度可根据模板和引物复杂程度,作适当的调整,一般在 50〜70 ℃ 之间,时间也可以缩短到 30 s;延伸温度与使用的 DNA 聚合酶有关,常见的 Pfu、Vent 等为 72 ℃ ,而用 Roche 公司的 Expand Long Template PCR System 中 DNA 聚合酶延伸温度为 68 ℃;延伸时间与模板长度和使用酶的效率有关,可参考相关商品酶使用说明书。


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