使用增强剂改善高（G+C）含量DNA模板的PCR扩增

许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟（G）和胞啥呢（C）碱基形成氢键，从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键，破坏由 G 和 C 间氢键形成的 DNA 分子二级或三级结 构。增强剂不仅可以提高 PCR 产物产量，而且对于提高 PCR 产物的专一性也有帮助，而在扩增 较长片段高（G + C）含量 DNA 模板时，增强剂更是必不可少。

使用增强剂改善高（G + C）含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟（G）和胞啥呢（C）碱基形成氢键，从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键，破坏由 G 和 C 间氢键形成的 DNA 分子二级或三级结构。增强剂不仅可以提高 PCR 产物产量，而且对于提高 PCR 产物的专一性也有帮助，而在扩增较长片段高（G + C）含量 DNA 模板时，增强剂更是必不可少。至今已有许多增强剂应用于高（G + C）含量 PCR 扩增，包括 DMSO （二甲亚碉）、甲酰胺、甘油、甜菜碱（betaine）、聚乙二 醇（polyethylene glycol， PEG）、7-脱氮-脱氧鸟嗦吟核昔三磷酸（7-deaza dGTP）、脱氧肌昔 （deoxyinosine）以及其它小分子酰胺类（amides）、砚类（sulfones）和亚砚类（sulfoxide）等有机试剂。

器材：

ToboCycler® Gradient 96 thermal cycler （Stratagene， La Jolla， CA， USA），电泳仪。

试剂：

① dNTP 和 Taq DNA 聚合酶（Stratagene 公司）

② 四亚甲基亚碉 [tetramethylene sulfox¬ide Acros Organics （USA）公司

③ 人骨髓白细胞 mRNA （Clontech）

④ RT-PCR 试剂盒（Strata¬gene 公司）

⑤ 琼脂糖（Promega 公司）

⑥ TAE 电泳缓冲液

⑦ Tris、HC1、KC1、MgCl2，明胶等为分析纯

使用增强剂改善高（G + C）含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本过程可分为如下几步，以人骨髓白细胞 mRNA 为例：

A 引物设计根据人骨髓白细胞 ojzm 基因序列设计上下游引物：

c-jun 1:5'-ATGACTGCAAAGATGGAAACG；

c-jun 2:5'-TCAAAATGTTTGCAACTGCTGCG

B 模板制备人骨髓白细胞 ojun cDNA，全长 996 bp，用 RT-PCR 试剂盒（Stratagene 公司）从人骨髓白细胞 mRNA（Clontech）反转录获得。

C 反应体系将下列各种成分加至 200』薄壁管：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.8），50 mmol/L KC1，1.5 mmol/L MgCl2，0.1 g/L 明胶，0.2 μmol/L 引物，0.2 mmol/L dNTP，0.06 ng/μL 模板，0.5 mol/L 四亚甲基亚砚。按 0.04U/μL 加 DNA 聚合酶（模板变性后添加），用水补足至总体积 50 μL。

D 反应条件将薄壁管放入 PCR 仪，升温至 95 ℃ 保持 5 min，以使模板 DNA 完全变性；降温至 54 ℃ 保持 5 min，在此期间按 0.04 U/Ml 添加 Tag DNA 聚合酶；按（95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min）进行 30 个循环反应；最后，72 ℃ 延伸 5 min。

E PCR 产物检测用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 反应产物。

1因不同增强剂对不同模板效果有所差异，用PCR扩增其它高（G+C）含量DNA模板时，如果没有PCR产物，可尝试使用本节所列其它增强剂。

2 PCR循环反应前，先 95 ℃ 变性5 min，一般可以将包括基因组DNA在内的大多数复杂DNA变性，在加四亚甲基亚碉作为变性剂时，变性温度甚至可以降到 92 ℃。

3 Taq DNA聚合酶对高温相对敏感，模板变性后添加Tag DNA聚合酶有利于保护酶的活性。若用Pfu DNA聚合酶，对高温稳定一些。

4 PCR循环扩增时，95℃变性1 min可以使非常复杂的模板变性；若以质粒克隆片段作模板，变性时间甚至可以缩短到30 s。退火温度可根据模板和引物复杂程度，作适当的调整，一般在50〜70℃之间，时间也可以缩短到30 s；延伸温度与使用的DNA聚合酶有关，常见的Pfu、Vent等为72℃，而用Roche公司的Expand Long Template PCR System中DNA聚合酶延伸温度为68℃；延伸时间与模板长度和使用酶的效率有关，可参考相关商品酶使用说明书。

1 因不同增强剂对不同模板效果有所差异，用 PCR 扩增其它高（G + C）含量 DNA 模板 时，如果没有 PCR 产物，可尝试使用本节所列其它增强剂。

2 PCR 循环反应前，先 95 ℃ 变性 5 min， 一般可以将包括基因组 DNA 在内的大多数复杂 DNA 变性，在加四亚甲基亚碉作为变性剂时，变性温度甚至可以降到 92 ℃。

3 Taq DNA 聚合酶对高温相对敏感，模板变性后添加 Tag DNA 聚合酶有利于保护酶的活 性。若用 Pfu DNA 聚合酶，对高温稳定一些。

4 PCR 循环扩增时，95 ℃ 变性 1 min 可以使非常复杂的模板变性；若以质粒克隆片段作模板，变性时间甚至可以缩短到 30 s。退火温度可根据模板和引物复杂程度，作适当的调整，一般在 50〜70 ℃ 之间，时间也可以缩短到 30 s；延伸温度与使用的 DNA 聚合酶有关，常见的 Pfu、Vent 等为 72 ℃ ，而用 Roche 公司的 Expand Long Template PCR System 中 DNA 聚合酶延伸温度为 68 ℃；延伸时间与模板长度和使用酶的效率有关，可参考相关商品酶使用说明书。