Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > PCR技术

PCR技术

NaOH对模板进行预处理改善高(G+C)含量DNA的PCR扩增

2024-05-14 PCR技术 加入收藏
简介DNA 在碱性溶液中不被降解,但一定浓度的碱性溶液可以破坏 DNA 的高级结构,使 DNA 处于变性状态。原理NaOH 对模板进行预处理改善高(G + C)

简介

DNA 在碱性溶液中不被降解,但一定浓度的碱性溶液可以破坏 DNA 的高级结构,使 DNA 处于变性状态。

原理

NaOH 对模板进行预处理改善高(G + C)含量 DNA 的 PCR 扩增的基本原理是 DNA 在碱性溶液中不被降解,但一定浓度的碱性溶液可以破坏 DNA 的高级结构,使 DNA 处于变性状态。被碱变性的 DNA,在 PCR 反应中不仅易于进行延伸反应,而且易于与引物结合,使 PCR 扩增得以顺利进行。

材料与仪器

器材:

480 DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer,Norwalk,CT,USA)、电泳仪。

试剂:

① Tag DNA 聚合酶和 dNTP(Stratagene 公司)

② 琼脂糖(Promega 公司)

③ Tris,HC1,KC1,NaAc,MgCl2,NaOH,EDTA,明胶等均为分析纯

步骤

NaOH 对模板进行预处理改善高(G + C)含量 DNA 的 PCR 扩增的基本过程可分为如下几步:

A 引物设计根据人内源性反转录病毒序列(genbank No. X16514,400〜1294)设计引物。

正向:5'-ATGCCAGGACAGATGGAG

反向:5'-TGCGGGGGTCTTGAGGGT

PCR 扩增片段长度 894bp。

B 模板处理 HRES-1/1 质粒,克隆有人内源性反转录病毒序列(EMBL accession number X16514),其中部分片段(X16514:1158〜1266)(G + C)含量高达 81%。将 10〜100 ng HRES-1/1 质粒溶于 1 ml 0.4mol/L NaOH 和 0.4 mmol/L EDTA 混合液,在室温处理 10 min。紧接着加 0.1 ml 3mol/L NaAc,混匀后加 2.2 ml(两倍体积)冷的无水乙醇。室温放置 30 min 后,离心(10000 r/min,10 min),沉淀用 70% 乙醇洗涤一次。在空气中干燥。

C 反应体系 NaOH 处理过的 HRES-1/1 质粒溶于 100 μl 含下列成分的 PCR 扩增混合液:

1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L Tris-Cl(pH8.3),50 mmol/L KC1,200 μmol/L dNTP,0.01% 明胶,1 μmol/L 引物,2.5U Tag DNA 聚合酶

D 反应条件按下面条件进行 30 个循环扩增:95 ℃ 1 min,51 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,再在 72 ℃ 延伸 5 min。

E 产物鉴定 0.8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 反应产物。

注意事项

1 由于 HRES1/1 克隆的 HRE 手 1 序列中部分片段(G + C)含量极高 [81%(G + C),长度 109 bp],添加甲酰胺(2.5%〜10%)或甘油(5%〜10%)作增强剂没有扩增出 PCR 产物,用沸水浴煮沸 5 min 模板,没有扩增出 PCR 产物,用热 PCR 方法也没有扩增出 PCR 产物。

2 用 NaOH 事先处理(G + C)含量较低的 DNA 模板,不会对 PCR 扩增产生负面影响。


文章底部广告位

文章评论

加载中~