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PCR技术

利用高温PCR体系改善高(G+C)含量DNA模板的PCR扩增

2024-05-14 PCR技术 加入收藏
简介DNA 模板形成的二级和三级结构,在高温环境中呈现变性或不完全变性状态。为了不使变性的 DNA 在低温下再次恢复复杂结构,将整个 PCR 扩增过程包括变性、

简介

DNA 模板形成的二级和三级结构,在高温环境中呈现变性或不完全变性状态。为了不使变性的 DNA 在低温下再次恢复复杂结构,将整个 PCR 扩增过程包括变性、退火和延伸都处于高温条件,使用高 Tm 值引物和耐高温的 DNA 聚合酶,便可以扩增高(G + C)含量 DNA 模板。

原理

利用高温 PCR 体系改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是高(G + C)含量 DNA 模板形成的二级和三级结构,在高温环境中呈现变性或不完全变性状态。为了不使变性的 DNA 在低温下再次恢复复杂结构,将整个 PCR 扩增过程包括变性、退火和延伸都处于高温条件,使用高 Tm 值引物和耐高温的 DNA 聚合酶,便可以扩增高(G + C)含量 DNA 模板。

材料与仪器

器材:

480 DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA)、电泳仪。

试剂:

① Taq DNA 聚合酶和 dNTP (Stratagene 公司)

② 琼脂糖(Promega 公司)

③ Tris、HC1、KC1、MgCl2,明胶等均为分析纯

步骤

利用高温 PCR 体系改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理的基本过程可分为如下几步:

A 引物设计根据基因序列设计如下引物。
正向:5'-TTGCCTCGCTCCGTCTCGCAGCC

反向:5'-AGCACGGAGAAGGATGGGGCGCG

以此引物扩增的部分原癌基因 c-myc 火序列长度为 179 bp,(G + C)含量为 76%。

B 模板制备母鸡输卵管基因组 DNA,从三周龄已注射雌二醇的来亨鸡(leghorn hen)中分离提取。

C 反应体系按下列配方添加各种成分至 200 μL 薄壁管:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3), 50 mmol/L KC1,1.5 mmol/L MgCl2,0.1 g/L 明胶,0.8 pmol/L 引物,0.2 mmol/L dNTP, 100 ng/μL 以模板,5% 甲酰胺。用水补足至总体积 10 μL。
上述 PCR 混合液在沸水浴煮沸 5 min,冷却至室温,按 0.065 U/μL 加 Taq DNA 聚合酶。

D 反应条件按下面条件进行 30 个循环扩增:94 ℃ 1 min, 70 ℃ 5 min。

E 产物鉴定 2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 反应产物。

注意事项

1 用两步热 PCR 扩增,要求引物 Tm 值较高,否则不能与模板结合,一般情况下引物冗值在 70〜75 ℃。


2 用 cDNA 或克隆于质粒的 DNA 作模板,虽然 PCR 扩增较容易一些,用常规的三步 PCR 方法也能获得产物,但在产量和专一性方面较差。


3 对于有些模板[如多巴胺受体基因,75% (G + C)]变性温度要求更高,要达到 98 ℃。在使用高变性温度时,要使用热稳定的 DNA 聚合酶,如 Vent (New England Biolab)或者是原 产菌株生产的 Pfu (Stratagene) (Stratagene 重组 Pfu 效果很差)。


4 退火和延伸温度一般在 70〜76℃之间,超过 76 ℃几乎没有 PCR 产物。


5 使用热 PCR 方法时,可能是引物与模板结合效率很低,或者是酶的效率降低,使退火和 延伸时间较长一些,若这部分时间短于 5 min,几乎没有 PCR 产物。


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