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PCR技术

从单层细胞制备用于DMS足迹分析的基因组DNA

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
材料与仪器DNAPBS 适用于样品细胞的培养液 裂解液 在15 cm培养血的单层培养细胞 双份样品 100%硫酸二甲酯(DMS) 缓冲液平衡酚 25:24:1

材料与仪器

DNA
PBS 适用于样品细胞的培养液 裂解液 在15 cm培养血的单层培养细胞 双份样品 100%硫酸二甲酯(DMS) 缓冲液平衡酚 25:24:1 (V V V)酚 氯仿 异戊醇 24: 1(V V)氯仿 异戊醇
50 mL和15 mL一次性使用的螺口聚丙稀管(如Corning) 带废液瓶的抽气装置 一次性细胞刮子 台式离心机(如IEC Centra-7R) 1.5 mL硅化的微量离心管 带管扣 封堵的巴斯德吸管或细玻璃棒

步骤


1) 在实验前先准备好以下溶液:在置于通风橱的37℃水浴中预热的PBS(约75 mL/ 15 cm培养皿);将每份24 mL细胞培养液加入到50 mL的一次性使用螺口聚丙烯管中,与PBS—样在37℃水浴预热。配制裂解液。


2) 对于对照(未处理的)细胞:弃去15 cm组织培养皿中的培养液,迅速加入约25 mL 预热的PBS,轻轻晃动几次,倒掉PBS。立即进行步骤5。


3) 对于体内DMS处理细胞:弃去15 cm组织培养皿中的细胞培养液。取24μL 100% DMS加至每份预热的培养液中(DMS终浓度0.1%),旋上盖子,倒转几次以混匀,然后将全部液体加入到组织培养皿中,让含0.1 % DMS的培养液与细胞接触恰好 2 min。


临用前才加入DMS,培养液中的水会很快使之失活。可通过调整温育的时间和(或)DMS的浓度,以得到最适的DMS足迹。


4) 用带废液瓶的抽气装置,吸出并弃去含0.1% DMS的培养液。轻轻地加入约25 mL 预热的PBS于细胞培养皿中,轻轻混合几次,然后吸去PBS。用预热的PBS如此反复洗培养皿3次,每次PBS在细胞上应停留30 s左右。


5) 对于处理的和未处理的细胞:尽量吸尽PBS,然后加入1.5 mL裂解液,轻轻摇动使裂解液均匀地布满整个细胞层的表面,室温放置约5 min。


6) 倾斜培养皿,然后用一次性细胞刮子将DNA细胞裂解液刮下,用吸管尽可能将裂解物全部转移至1个15 mL聚丙烯管中。


7) 细胞裂解液在37℃温育3〜5 h,每隔30〜60 min混合1次。温育过程中,用蛋白酶K消化细胞蛋白质。结束温育后,样品可在-20℃无限期储存,在使用之前应先融化并使其温度至室温。


8) 加入1.25倍体积的缓冲液平衡酚,轻轻颠倒30次充分混匀。在台式离心机上室温 1300 g (在 IEC Centra-7R 离心机上为 2500 r/min)离心 10 min。用23 cm 的巴斯德吸管穿过水相和界面插至管底,吸去底层的酚。如果黏性的DNA被带至有机相,可用吸头吹出空气气泡而使其分离。不要触动界面,因为在界面处有许多DNA。用酚重复抽提1次。


9) 加入1倍体积酚/氯仿/异戊醇,轻轻颠倒约30次充分混匀。室温500 g (在IEC Centra-7R离心机上为1500 r/min)离心10 min,如步骤8用23 cm的巴斯德吸管头从底部吸走酚/氯仿/异戊醇。勿触动界面,重复此抽提步骤1次。


10) 加入1倍体积的氯仿/异戊醇,轻轻颠倒约30次充分混匀。室温200 g离心5 min, 如步骤8用巴斯德吸管从底部吸走氯仿/异戊醇溶液。


11) 加入1倍体积乙醚,轻轻颠倒约30次重复混匀。通过重力作用使其分层(约 1 min),用一根巴斯德吸管吸取乙醚(上相),在通风橱中使所有残余的乙醚完全 挥发(约5 min)。


12) 加入1倍体积异丙醇,轻轻颠倒约30次使其混合完全。


13) 将纤维状的DNA沉淀缠绕在已封堵的23 cm长的巴斯德吸管上或细玻璃棒上,小心地从异丙醇溶液带出,将DNA轻压试管内壁使多余液体流去。


14) 将缠绕着的DNA置于3 mL pH 7.5的TE缓冲液,室温下轻轻摇数小时至过夜使 DNA重新溶解。


15) 加入330μL 3 mol/L乙酸钠和6.7 mL冰冷的100%乙醇,轻轻颠倒约30次充分混匀。如步骤12和13,重新沉淀和缠起DNA。


16) 将缠绕着的DNA置于200〜500μL pH 7.5的TE缓冲液,室温放置过夜或4℃放置数天,在此过程中不时地轻轻颠倒几次,使DNA重新溶解。溶解完全后,用分光光度计测定DNA浓度,并将其浓度调为0.5〜1 mg/mL,储于4℃。对照DNA (没有用DMS处理)质量应较高,此时可用于基因组测序和基因组甲基胞嘧啶分析(Garrity and Wold,1992)。


17) 将约75〜175μL对照DNA加入到一个硅化的1.5 mL微量离心管中,加入TE缓冲液至175μL


18) 在495μLH2O中加入5μL100% DMS得到1% DMS溶液,振荡25 s充分混匀, 稍加旋转离心,收集液滴。DMS应试几个不同的浓度,以确定与用于步骤3和4的体内条件最为匹配的条件。


19) 加入25μL1% DMS溶液于对照DNA中,轻轻颠倒约25 s充分混匀。避免DMS 溶液粘在管盖上,如有黏附,可稍加旋转离心。室温温育恰好2 min,然后加入50 μL冰冷的DMS终止缓冲液。立即加入750μL在干冰上预冷的100%乙醇,剧烈摇动使其混合,将管子插入碎干冰中,让样品在干冰上放置约30 min。


20) 与体外DMS处理的样品平行,制备经体内处理的DNA待哌啶处理。将200μL DNA (来自步骤16)与50 冰冷的DMS终止缓冲液混合,在涡旋混合器上稍加振荡(3 s)。加入750μL冰冷的100%乙醇,剧烈摇动混合。将管子插入干冰中,让样品在干冰上放置约30 min。


21) 将两种DNA沉淀样品(来自步骤19和20)4℃离心l0 min,弃上清。将沉淀加入1 mL室温的75%乙醇,在涡旋混合器上稍加振荡(5 s)直至沉淀离开管壁。4℃离心10 min,弃上清。


22) 用水按1:10稀释哌啶至终浓度为1 mol/L,往每种DNA沉淀中加入200μL。室温下温育以重溶DNA,并间或在涡旋混合器上振荡。沉淀通常可在15 min左右溶解。仔细检查样品确定DNA已完全溶解,没有溶解的沉淀在1 mol/L的哌啶中会形成小透镜状的清晰漂浮物。注意:应在通风橱中分装哌啶。


23) 当沉淀已完全溶解,稍加旋转离心以收集液滴。扣上管扣,在通风橱中于90℃加热 30 min。用哌啶加热处理可以使基因组DNA在甲基化的鸟嘌呤处断裂,使DNA变性并破坏污染的RNA。


24) 打开管扣,稍加离心以收集冷凝液滴。置样品于干冰上冷却10 min。用Speedvac 真空旋转蒸发器在室温蒸发1〜2 h,除去哌啶。


25) 沉淀用360μL pH 7.5的TE缓冲液重悬。加入40μL 3 mol/L pH 7.0的乙酸钠,在涡旋混合器上振荡混匀;加入1 mL冰冷的100%乙醇,剧烈摇动以充分混匀,-20℃至少放置2 h以上。


26) 样品在4℃离心15 min,弃上清。沉淀用pH 7.5的TE缓冲液500μL重悬,加入 170μL 8 mol/L乙酸铵,在涡旋混合器上振荡混匀;加入670μL异丙醇,剧烈摇动以充分混匀,-20℃放置至少2 h。


27) 样品在4℃离心15 min,弃上清。加入500μL室温的75%乙醇,在涡旋混合器上 振荡,样品在4℃离心15 min,弃上清,并用吸管吸去残余的痕量乙醇。


28) 沉淀用50μL水重悬,然后在Speedvac蒸发器中干燥1 h。重新溶解沉淀于TE缓冲液中,使DNA终浓度约为1μg/mL。


29) 样品在室温离10 min,将上清液转移至一个新的经硅化的微量离心管中,如有胶状沉淀存在,弃去。用分光光度计对DNA定量,并用pH 7.5的TE缓冲液将浓度调至0.4μg/μL,此时的样品可用于连接介导PCR。

常见问题

其他试剂:


乙醚,异丙醇,TE缓冲液,pH 7.5 ,3 mol/L 乙酸钠,pH 7.0,100%乙醇,室温或干冰冷却,75%乙醇,室温,冰冷的DMS终止缓冲液,哌啶,8 mol/L乙酸铵


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