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EDTA 矿物油 TN 缓冲液 PCR 缓冲液 聚合酶混合液 XmaⅠ XmaⅠ缓冲液 DNAdNTP 溶液 各稀释的第二次杂交样品 PCR 引物
热循环仪 水浴箱 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备 酚

第 1 阶段：用于 MOS 和 XmaⅠ消化的 PCR 扩增

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

EDTA,0.2mol/L

矿物油

TN 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6，10mmol/LNaCl)

2. 酶和酶缓冲液

PCR 缓冲液，10X(40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸镁，10mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA，或者厂商提供）

聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）

XmaⅠ(10U/ul)

XmaⅠ缓冲液，10X

3. 核酸和寡核苷酸

DNA

dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)

各稀释的第二次杂交样品（来自方案 2 第 17 步）

PCR 引物 P1

PCR 引物 NP2R

PCR 引物 P1

4. 专用设备

热循环仪

水浴，预设为 37°C 和 74°C

5. 附加试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂

二、方法

1. 用于 MOS 的初级 PCR 扩增

(1) 从每个稀释的第二次杂交产物中（来自方案 2 第 17 步）各取 10ul，加到标记好的管子中。

(2) 按照下表，配制用于初级 PCR-1 的主体混合液。这个配方足够做一个反应。根据要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。



(3) 混匀，并短暂离心。

(4) 将 115ul 主体混合液分装到第 1 步的反应管中。

(5) 将最终的 125ul 混合液，分装到 5 个 0.5 ml(原文为 ul—译者改）的 PCR 管中(每管 25ul)。

(6) 用 1 滴矿物油覆盖。

(7) 将反应混合液在热循环仪中 74°C 温育 5 min，以延伸接头，然后立即开始以下循环。



(8) 从 5 个初级 PCR-1 产物中，各取 2ul 到一个管中混合，并加 390ulH20。

(9) 从第 8 步稀释的每个初级 PCR-1 产物混合液中，各取 1ul 到一个标记妤的 PC 管中。

(10) 按照下表，配制用于初级 PCR-2 的主体混合液。



(11) 混勻，并短暂离心。

(12) 将 24ul 主体混合液分装到第 9 步的各反应管中。

(13) 用 1 滴矿物油覆盖。

(14) 立即开始以下循环。



(15) 从每个反应产物中，各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。

2. 用于 MOS 的次级 PCR

(16) 从上面第 14 步产生的每个初级 PCR-2 混合液中，各取 2ul, 用 38ulH20 稀释。

(17) 从每个稀释的初级 PCR-2 产物混合液中，各取 2ul，分装到标记好的管子中。

(18) 按照下表，配制用于次级 PCR 的主体混合液。这个配方足够做一个反应，根据需要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。



(19) 混匀，并短暂离心。

(20) 将 48ul 主体混合液分装到第 2 步的反应管中。

(21) 用 1 滴矿物油覆盖。

(22) 立即开始进行 10~12 个循环：95°C 10s，68°C10s,72°C1.5 mm。

(23) 从每个反应产物中各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。

(24) 用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化次级 PCR 产物。

(25) 用 20~40ulTN 缓冲液溶解沉淀，使 DNA 浓度为 20ng/ul

(26) 取 2ul 纯化的 PCR 产物，在 2.0% 琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分析。

(27) 用 1.6 mlH20 稀释 14 第 10 步纯化的 PCR 产物（这将作为未消化的对照）。

(28) 反应产物保存在-20°C。

3.XmaI 消化

(29) 在管中加入下列试剂



(30) 混匀，然后在 37°C 温育 2 h。

(31) 加入 2ul 0.2mol/LEDTA，以终止反应。

(32)74°C 温育 5 min, 使酶失活。

(33)-20°C 保存。

第 2 阶段：MOS 杂交

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

稀释缓冲液（20 mmol/LHEPES-HC1、pH8.3,50 mmol/LNaCl 和 0.2 mmol/LEDTA)

4X 杂交缓冲储存液：4mol/LNaCl，200 mmol/LHEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷

基三乙基溴化铵（CTAB)，最终的 1X 杂交混合液用稀释缓冲液来稀释矿物油

2. 核酸和寡核苷酸

XmaI 消化的 DNA

3. 专用设备

热循环仪

二、方法

1. 在一个 1.5 ml 的离心管中，混合以下试剂。



2. 从混合液中，取 2ul 到一个 0.5 ml 的离心管中，用 1 滴矿物油覆盖。

3. 在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。

4. 在热循环仪中 68°C 温育 3 h。

5. 在管中加 200ul 稀释缓冲液，并吹吸混匀。

6. 在热循环仪中 70°C 加热 7 min。

7.-20°C 保存。

第 3 阶段：MOSPCR 扩增

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP, 每种为 lOmmol/L)

矿物油

2. 酶和酶缓冲液

PCR 缓冲液，lOX（4Ommol/L Tricine KOH、22°C 下 pH9.2，3.5 mmol/L 乙酸镁，10 mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA, 或者厂商提供）

聚合酶混合液，50X(Advantage2,Clontech, 或相当产品）

3. 核酸和寡核苷酸

稀释的 DNA 样品（杂交后的样品及相应的未消化对照，方案 4 第 2 阶段第 6 步和方案 4 第 1 阶段第 26 步）

MOSPCR 引物（NP2Rs)

4. 专用设备

热循环仪

5. 附加试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

二、方法

1.按照下表，为所有的 MOSPCR 配制主体混合液。



2.在标记好的含有 24ul 主体混合液的管子中，各加 lul 稀释的 DNA 样品（杂交后样品及相应的未消化对照）。

3.用 1 滴矿物油覆盖。

4.将反应混合液放在热循环仪中，74°C 温育 5 min, 以延伸接头（不要将样品从热循环仪中取出）。

5.立即开始下面的循环。

6.从每个管中，各取 4ul 在琼脂糖凝胶上分析。

7.反应产物保存在-20°C。