PCR引物设计及相关软件使用

主要内容：背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件Primer Premier 5.0 介绍Oligo 6.22 介绍在线Primer3 介绍

一、PCR

聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction ,PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。

二、PCR引物设计

引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。

三、引物设计的原则

引物与模板的序列要紧密互补

引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构

引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应（即错配）。

（一）具体因素

如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值（melting temperature），引物与模板形成双链的内部稳定性（internal stability, 用？G 值反映），形成引物二聚体（primer dimer）及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

（二）一般原则

1. 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-24 bp,但不应大于38.

引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。

例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点（3 x 109/412=200 ）。而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个。