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PCR技术

PCR 纯化回收

2024-05-16 PCR技术 加入收藏
原理PCR 产物可通过硅胶柱纯化回收,硅胶膜在高盐度缓冲液中可以结合 DNA,低盐度缓冲液或水可洗脱 DNA(硅胶膜表面的硅胶醇基团呈弱酸性,水化后带负电荷。当

原理

PCR 产物可通过硅胶柱纯化回收,硅胶膜在高盐度缓冲液中可以结合 DNA,低盐度缓冲液或水可洗脱 DNA(硅胶膜表面的硅胶醇基团呈弱酸性,水化后带负电荷。当溶液中存在一定浓度的阳离子后,形成的阳离子电子桥能够中和 DNA 和硅烷醇基团之间的表面负电荷,从而使 DNA 牢固的吸附在硅胶膜表面。相反,处于低盐水溶液状态下时,由于硅胶膜的硅烷醇基团与 DNA 磷酸基团之间的静电排斥,硅胶膜释放 DNA)。

用途

聚合酶链式反应产物中通常会含有过量的引物、dNTP、酶等,这些会对后续核酸序列测定、酶切、载体构建等产生影响,通过 PCR 纯化回收可获取纯的 DNA 扩增产物。

材料与仪器

1.高压灭菌 ddH2O

2.小型离心机

3.水浴锅

4.高压灭菌 Ep 管

5.PCR 产物纯化回收试剂盒

步骤

1.在紫外投射仪或凝胶成像仪上,用刀片切取包含目的条带的琼脂糖凝胶并称重;

2.一般以 0.1g 胶加入 100μl 溶胶液的比例(具体根据试剂盒说明添加),按凝胶实际重量加入溶胶液,水浴锅中 55℃ 溶胶(期间可缓慢震动 Ep 管,将胶溶解完全);

3.回收试剂盒中会配有回收柱和废液管,将溶解好的溶液加入回收柱中,并将回收柱套入 2ml 废液管中;

4. 12000 r/min 离心 30-60s,去除废液;

5.将 500μl 漂洗液加入回收柱,并将回收柱重新套入 2ml 废液管中,12000 r/min 离心 60-90s,去除废液;

6.重复漂洗一次去除废液;

7. 12000 r/min 离心 2min,将回收柱套入高压灭菌后的 1.5ml Ep 管中;

8.向回收柱正中央的滤膜上滴加 20-30μl 洗脱 buffer 或高压灭菌 ddH2O,静置 5-15min;

9. 12000 r/min 离心 90-120s;

10. 将 1.5ml Ep 管中的回收产物再次滴入到回收柱中央的滤膜上,或向滤膜中央再加 10μl 洗脱 buffer 或高压灭菌 ddH2O,继续静置 5-15min;

11. 12000 r/min 离心 120s,1.5ml Ep 管中收集到的溶液即为纯化回收的 PCR 产物。

注意事项

1. 切取的包含目的条带的琼脂糖凝胶需称重,并按照试剂盒说明要求按比例添加溶胶液;

2. 溶胶需充分;

3. 回收管、ddH2O 要提前高压灭菌;

4. 为尽量提高回收率可以将回收产物再次过柱、离心。

常见问题

对于后续要进行核酸序列测定或酶切构建的 PCR 产物,最终溶解时需用高压灭菌的 ddH2O,盐离子缓冲液、Tris-HCl 会影响相关实验效率。


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