大规模 PCR 制作 cDNA 微阵列实验

缓冲液、溶液和试剂 生物分子 酶和酶缓冲液 核酸和寡核苷酸 凝胶
专用设备

第 1 阶段：影印铺板与工作库的制备

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

羧苄西林（100ug/ml 储存溶液）

乙醇（100%)

甘油，45%(体积分数）

LB 液体培养基。（1L LB 液体培养基含有 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、5 gNaCl)

超级液体培养基。(1L 超级液体培养基含有 32 g 胰蛋白胨、20 g 酵母提取物、5 gNaCl、5 ml 1mol/LNaOH）

2. 生物分子

核对过序列的母系克隆或 EST(例如，gf211release，ResearchGenetics)

3. 其他仪器

具有水平（吊桶式）转头的离心机，深度 6.2 cm, 可以离心微量滴定板和过滤板（例如，Sorvall SuperT 21，Sorvall)

Airpore Tape Sheets(Qiagen)

Bunsen 喷灯

培养箱，预设为 37°C

96 针接种器（V&P Scientific)

深 96 孔微量滴定板，1.0 ml,PP(V WR International)

U 形底的 96 孔微量滴定板（Corning)

纸巾

带有深孔板固定装置的振荡培养箱，37°C

带拉链的袋子（zip-lock bag)，1 加仑（约 4L)

二、方法

1.将密封的母系克隆板在 37°C 下培养过夜。

2.准备制备克隆系的工作复本：标记 96 孔圆底（U 形底）的微量滴定板，在每一个孔中分装 100ulLB 液体培养基，含有100ug/ml 羧苄西林。
用这些工作复本来保持母系克隆。检验确保这些克隆都具有载体赋予的氨苄西林抗性。

3.在水平式微量滴定板转头中离心母系克隆板，1000r/min 离心 2 min，除去板子封条上的冷凝水。

4.在一个小烧杯中装一些 100% 乙醇，将 96 针复制工具在乙醇中浸泡。然后从乙醇中取出工具，并烧接种针。

5.短暂冷却后，将复制工具在母系克隆板中蘸一下，然后转到工作克隆板上。如果必要，每个板子都重复接种一次。

6.将接种后的 LB 板子盖上盖子，放到装有湿纸巾的 1 加仑（3.78541dm3) 带拉链的袋子中，将袋子密封后，在 37C 培养过夜。

7.在深孔板的每个孔中，分装 1ml 含有 100ug/ml 羧苄西林的超级液体培养基。
这些板子将作为制备模板的培养液的来源。

8.1 天后，用复制工具直接从新鲜的 LB 板中接种至深孔板。

9.用 Qiagen Airpore Tape Sheets 将深孔板密封，并在上面盖上塑料盖，在 37°C 振荡培养箱中以 200r/min 培养 24 h。

10.对于要被冷冻（-80°C) 作为以后培养源的板子，在每个孔中加入 5ul 45%(体积分数）的无菌甘油。从剩下的板子中分离质粒模板。

第 2 阶段：质粒模板的分离

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

乙醇，70%

T low E 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl，O.lmmol/LEDTA,pH8.0)

2. 离心机和转头

具有水平（吊桶式）转头的离心机，深 6.2 cm, 可以离心微量滴定板和过滤板（例如，Sorvall SuperT 21,Sorvall)

3. 专用设备

封板器

涡旋混匀器

4. 载体和细菌菌株

从上面第 1 阶段第 9 步获得的细菌培养液

&附加试剂

AlkalineLysisMiniprepkit,96 孔 (EdgeBiosystems)

二、方法

1. 将裂解缓冲液（Edge Biosystems Kit) 加热到 37°C, 使 SDS 溶解。

2. 加入 lml 的 RNA 酶溶液至 100 ml 重悬浮缓冲液（Edge Biosystems Kit) 中。在 4°C可保存 3 个月。

3. 在 EdgeBiosystemsKit 接收板的每个孔中，加入 350ul 细菌培养液。将过滤板放在其顶部，并用带子固定。

4. 用装有 96 孔板转头的离心机，将深孔板中的细菌培养液以 1500 g 离心 7 min。

5. 迅速地在干净的纸巾上将板子颠倒，并轻扣出剩余的培养基。
这一步不要耽搁，否则沉淀会松动，在倒出培养基时可能损失。

6. 每个沉淀各加 100ul 悬浮缓冲液重新悬浮，涡旋混匀，直到所有的沉淀都悬浮起来。
悬浮不充分会造成细胞呈块状，在随后的步骤中不会裂解。

7. 在每个孔中加 100ul 裂解缓冲液，轻轻摇动板子混合 lmin, 避免使细菌染色体 DNA断裂。

8. 在每个孔中加 100ul 沉淀缓冲液，混合 1 min。

9. 在每个孔中加 100ul 中和缓冲液，并涡旋混匀 20s。

10. 将深孔板中的混合物转到预先装配好的过滤/接收组装板中。

11. 在装有 96 孔板转头的离心机中，将叠起来的板子以 1500 g 离心 12 min。

12. 取下并弃去过滤板，从接收板中倒出乙醇和滤出液，在干净的纸巾上吸干剩余的乙醇。

13. 在每个孔中加入 500ul 70% 乙醇，立即倒出，并在干净的纸巾上吸干剩余的乙醇。

14. 除去盖子，将板子放在干净的抽屉中，并用干净的纸巾覆盖，干燥过夜。

15. 各加 200ul T low E 缓冲液，悬浮每个 DNA 沉淀，用封板机将板子顶部密封，使沉淀在 4°C 再水化至少 2 天。若长期保存，应放在-20°C。

第 3 阶段：克隆的扩增与 PCR 产物的评估

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

DEPC 处理过的 H20

TAE 缓冲液，1×（40 mmol/L Tris-乙酸盐，1 mmol/L EDTA，pH 约 8.5)

DNA 点样缓冲液（200 g/LFicoll400，0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0,10 g/LSDS，2.5 g/L 溴酚蓝，2.5 g/L 二甲苯腈)

dATP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)

dGTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)

dTTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)

dCTP 溶液，100mmol/L(Pharmacia)

2. 酶和酶缓冲液

AmpliTaq DNA 聚合酶（Perkin-Elmer)

GeneAmp PCR 缓冲液，10X(Applied Biosystems)

3. 核酸和寡核苷酸

载体或基因特异性引物（1mmol/L)

100bp DNA ladder(New England Biolabs)

4. 凝胶

球脂糖凝胶（20 g/L,TAE 缓冲液)

5. 专用设备

薄壁 PCR 板和 Cycleseal PCR 板封板器（Robbins Scientific)

可容纳 4 个 50 孔梳子的电泳装置

热循环仪

6. 附加器材

琼脂糖凝胶电泳所需的设备和试剂，包括溴化乙锭

1. 为每个要扩增的 96 孔板配制含有以下成分的主体 PCR 混合液。

PCR 缓冲液，10X(含有 15 mmol/LMgCl2)1000ul

dATP(100mmol/L)20ul

dGTP(100mmol/L)20ul

dCTP(100mmol/L)20ul

dTTP(100mmol/L)20ul

引物 1(lmmol/L)5ul

引物 2(lmmol/L)5ul

AmpliTaq 聚合酶（5U/ul)100ul

DEPC 处理过的 H20 8800ul

2. 标记好 96 孔 PCR 板，在每个孔中分装 100ulPCR 混合液。
轻扣 PCR 板，确保没有气泡残留在孔的底部。

3. 在每个孔中加入 1ul 纯化过的质粒模板，并盖好盖子。

4. 进行下面的循环反应。



在进行质量对照的凝胶分析时，将板子保存在 41°C。

5. 通过琼脂糖凝胶电泳，检测 PCR 产物。
凝胶成像只能对产物进行粗略的定量，但可以提供很好的产物组成的特征。

6. 从每个孔中取 2ul, 与 2ul 点样缓冲液混合。

7. 以 100bp DNA ladder 作为标准，在 2% 琼脂糖凝胶上分析样品。
每个泳道应该显示一条单一的主带，各泳道之间产物的亮度应该相同。

第 4 阶段：PCR 产物的纯化与定置

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

乙醇/乙酸盐混合液 (95% 乙醇，5%3mol/L 乙酸钠，PH6.0)

乙醇，70%

SSC 缓冲液，20X(3mol/LNaCl，0.1mol/L 柠檬酸钠·2 H20，用 1mol/LHCl，调 pH 至 7.0)

TAE 缓冲液，1X(40 mmol/LTris-乙酸盐，1mmol/LEDTA，pH 约 8.5)

DNA 点样缓冲液（20%Ficoll400,0.1mol/LNa2EDTA,pH8.0，10 g/LSDS，2.5 g/L 溴酚蓝，2.5 g/L 二甲苯腈)

2. 离心机和转头

具有水平（吊桶式）转头的离心机，深 6.2 cm, 可以离心微量滴定板和过滤板（例如，SorvallSuperT21，Sorvall)

3. 核酸和寡核苷酸

100bpDNAladder(New England Biolabs)

双链 DNA 标准样，变化范围是 0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml

参考双链 DNA(0.5ug/ml)(Invitrogen)

4. 凝胶

琼脂糖凝胶（20 g/L,TAE 缓冲液）

5. 专用设备

V 形底的 96 孔微量滴定板（Corning)

Immunowash 微量滴定板清洗仪（BioRad)

纸巾

可热封的储存袋和热封器

65°C 培养箱

可容纳 4 个 50 孔梳子的电泳装置

电泳电源

用于荧光检測的 96 孔板（Dynex)

荧光计（例如，Perkin-Elmer Analytical Instruments)

6. 附加器材

FluoReporter Blue dsDNA Quantitation Kit(Molecular Probes)

二、方法

1. 在 V 形底 96 孔板的每个孔中，加入 200ul 乙醇/乙酸盐混合液。

2. 将每个孔中的 100ulPCR 产物，转到 V 形底的板子中，并用 75ul 移液管吹吸 4 次混匀。

3. 将板子放在-80°C 冰箱 1h, 或者在-20°C 保存过夜。

4. 将板子解冻以降低其脆性，并溶解孔中可能形成的冰。

5. 将板子放入带有微量滴定板转头的离心机中，以 2600 g、4°C 离心 40 min。

6. 用 Immunowash 微量滴定板清洗仪吸去每个孔中的上清液。
建议在每个孔的底部留约 10~20ul, 以避免将沉淀搅起。

7. 用 Immunowash 微量滴定板清洗仪在每个孔中加入 200ul70% 乙醇。

8. 以 2600 g 4°C 离心 40 min。

9. 用 Immunowash 微量滴定板清洗仪将每个孔中的上清液吸去。

10. 用纸巾将板覆盖，在一个封闭抽屉中干燥过夜。

1.PCR 产物的重悬浮

11. 在每个孔中，加入 40ul3XSSC。用薄片密封器或合适的封条将板子封好，注意要将每个孔都封严。
重新悬浮 PCR 产物的缓冲液，是由制作微阵列的点样仪和芯片决定的。

12. 将板子放在热封的袋子中，里面放有 3 X SSC 浸湿的纸巾。

13. 将袋子在 65°C 培养箱中放置 2 h, 关掉培养箱使板子逐渐冷却。
在培养箱中冷却板子，可以避免封条上产生冷凝水。

14. 取 1ul 重新悬浮的 PCR 产物，在 2% 琼脂糖凝胶上分析，如第 3 阶段中所述。
充分的沉淀和重悬浮，将产生非常亮的条带。

15. 装有重悬浮 PCR 产物的板子，在- 20°C 保存备用。

2. 用荧光测定法对 PCR 产物定量

16. 在荧光测定专用 96 孔板的每个孔中，加入 200ul 荧光剂缓冲液（FluoReporter Blue dsDNA Quantitation Kit)。

17. 在荧光测定板的每个孔中，加入 1ulPCR 产物。

18. 在荧光测定板的最后一排，各加 1ul 双链 DNA 标准样，分别为 0、50ug/ml、100ug/ml、250ug/ml、500ug/ml dsDNA。

19. 设定荧光计激发光为 346nm, 发射光为 460nm。

20. 在 0~500ug/ml  dsDNA 的范围内，测试标准样是否悬线性的，以及是否可重复。

21. 从所有对照和其他样品测得的数值中，减去 0ug/ml 样品的数值后，按照下面的方程
计算 PCR 产物中 dsDNA 的浓度。



22. 根据上面的计算，对于超出预计印刷浓度范围（0.1~0.5ug/ul) 的 PCR 产物，要调整浓度。

第 5 阶段：印制微阵列

完成了前面的方案，研究者将会得到制作微阵列所必需的点样材料。印制微阵列的方案参数是由所使用的点样仪和芯片决定的。由于有几种点样仪和芯片的组合可以用来制作微阵列，这里不再给出 PCR 产物点样的详细方案，可以在其他地方找到（Bowtell and Sambrook 2003)。