激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增实验
材料与仪器RNA寡核苷酸引物 脱氧核苷三磷酸 RT RNA PCR 酶 AccuRT 缓冲液 UNG 琼脂糖 溴化乙锭 二甲基亚砜 乙酸镁 去除 RNA 酶的水
材料与仪器
RNA寡核苷酸引物 脱氧核苷三磷酸 RT RNA PCR 酶 AccuRT 缓冲液 UNG 琼脂糖 溴化乙锭 二甲基亚砜 乙酸镁 去除 RNA 酶的水 SYBRGreen I Dye
琼脂糖凝胶的电泳设备
琼脂糖凝胶的电泳设备
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
琼脂糖
二甲基亚砜（见注释 1)(DMSO)
溴化乙锭
乙酸镁（见注释 2)[(CH3COO)2 Mg]25 mmol/L(AppliedBiosystems4339582/4339585)
去除 RNA 酶的水
SYBRGreen I Dye(见注释 1)(分子探针）
2. 酶和酶缓冲液
5XAccuRT 缓冲液（见注释 2)(Applied Biosystems 4339582/4339585)
Gene Amp Accu RT RNA PCR 酶（见注释 2):3.75U/ul(Applied Biosystems 4339585)
AmpErase 尿嘧啶-N-糖基酶（UNG):1U/ul(AppliedBiosystems)
3. 核酸和寡核苷酸
脱氧核苷三磷酸：中性10mmol/L 溶液（AppliedBiosystems，N808-0007/N808-0095含 20 mmol/LdUTP 以替代 dTTP)。
寡核苷酸引物：15umol/L 溶于 10 mmol/LTris-HCl 溶液,pH8.3。
RNA：通常保存于含载体 RNA 的溶液中，如 30ug/mlE.colirRNA 或 poly(rA)，或保存于 10 mmol/LTris-HCl、pH7.0，lmmol/LEDTA,0.lmmol/LNaCl 中，两者都需去除 RNA 酶的水。
4. 特殊设备
琼脂糖凝胶的电泳设备
GeneAmpPCR 系统 9700/2700(AppliedBiosystems) 或类似产品实时定量 PCR 检測系统（见注释 1): 例如 AppliedBiosystems 的 GeneAmp5700 测序系统或 ABIPRISM7000、7700/7900 HT 测序系统或 RocheAppliedScienceLightCycler
5. 其他
MicroAmp 反应管（AppliedBiosystems) 或类似产品
二、方法
1.RNA 分离
制备高质量的 RNA 极为重要，对此市场上有许多商业化产品以及详细的方法可用
(DieffenbachandDveksler1995;Farrell1998;SambrookandRussell2001; 第 10 章）。
2.RT 和 PCR 扩增的组合
(1) 有 dTTP 而无 UNG 下进行的反应
①解冻所有试剂，轻微振荡，避免产生泡沫。
②在微型离心机中将酶和试剂甩至管底，置冰上。
③混合下列试剂（注意：黑体字项目在有 dUTP 和 UNG 时浓度是不同的）。
④轻微振荡上述混合物，加 1.00ulRNA(至 1ug，见 16.1 疑难解答和技巧），轻微振荡整个反应混合物。可以使用任何比例的去除 RNA 酶的水和 RNA 的混合物，只要主要混合物和 RNA 的总体积等于 50ul。
⑤在 GeneAmpPCRSystem9700/2700 上按下列程序进行反应。
65°C，保持 30 min(反转录）
95°C，保持 lmin
95°C，15s;65°C，30s, 进行 40 个循环（PCR 扩增）
65°C, 保持 7 min
⑥反应物可直接用于分析或于-20°C 储存。
(2) 使用 dUTP 和 UNG 进行反应（针对污染控制系统和 UNG 介导的热启动）
①解冻所有试剂，轻微振荡，避免产生泡沫。
②在微型离心机中将酶和试剂离心到管底，置冰上，
③混合下列试剂（注意：黑体字项目在进行有 dTTP 和无 UNG 反应时使用不同浓度）。
④轻微振荡上述混合物，加 1.00ulRNA(至 1ul; 见 16.1 疑难解答和技巧），轻微振荡整个反应混合物。可以使用任何比例的去除 RNA 酶的水和 RNA 的混合物，只要主要混合物和 RNA 的总体积等于 50ul。
⑤在 GeneAmpPCRSystem9700/2700 上按下列程序进行反应。
50°C, 保持 2 min(UNG 步骤)
65°C，保持 30 min(反转录步骤）
95°C，保持 lmin
95°C,15s;65°C，30s, 进行 40 个循环（PCR 扩增）
65°C，保持 7 min
⑥反应物可直接用于分析，为使 UNG 失活，可于-20°C：储存或进行化学处理（如用等体积的氯仿进行抽提），因 UNG 长期存在会破坏扩增产物。反应物可长期储存于-20°C：。UNG 在分析之前不需要进行失活，然而在室溫或者低于 55°C 时它能破坏反应中的复制子。
3. 反应产物分析
为检测扩增产物，可用含 0.5ug/ml 溴化乙锭（EB) 的 2% 琼脂糖进行电泳，也可用实时定量 PCR 的 TaqMan 技术（Mengetal.2001)。用 EB(HiguchiandWaston1999;KangandHolland1999;Kangetal.2000;Holland2002) 或 SYBRGreenI(Baranzinietal.2000) 染色，通过 EB 或 SYBRGreenI 结合反应产物双链 DNA 发出的荧光来检测。当使用 SYBRGreenI 时，浓度控制非常重要，20 倍母液存于 100%DMSO(20 倍母液指 500 倍 SYBRGreenI 存于 DMSO 溶液），使用的最终浓度为 0.2 倍，高于该浓度据证实会抑制 RT 反应的许多酶的活性。
1. 缓冲液、溶液和试剂
琼脂糖
二甲基亚砜（见注释 1)(DMSO)
溴化乙锭
乙酸镁（见注释 2)[(CH3COO)2 Mg]25 mmol/L(AppliedBiosystems4339582/4339585)
去除 RNA 酶的水
SYBRGreen I Dye(见注释 1)(分子探针）
2. 酶和酶缓冲液
5XAccuRT 缓冲液（见注释 2)(Applied Biosystems 4339582/4339585)
Gene Amp Accu RT RNA PCR 酶（见注释 2):3.75U/ul(Applied Biosystems 4339585)
AmpErase 尿嘧啶-N-糖基酶（UNG):1U/ul(AppliedBiosystems)
3. 核酸和寡核苷酸
脱氧核苷三磷酸：中性10mmol/L 溶液（AppliedBiosystems，N808-0007/N808-0095含 20 mmol/LdUTP 以替代 dTTP)。
寡核苷酸引物：15umol/L 溶于 10 mmol/LTris-HCl 溶液,pH8.3。
RNA：通常保存于含载体 RNA 的溶液中，如 30ug/mlE.colirRNA 或 poly(rA)，或保存于 10 mmol/LTris-HCl、pH7.0，lmmol/LEDTA,0.lmmol/LNaCl 中，两者都需去除 RNA 酶的水。
4. 特殊设备
琼脂糖凝胶的电泳设备
GeneAmpPCR 系统 9700/2700(AppliedBiosystems) 或类似产品实时定量 PCR 检測系统（见注释 1): 例如 AppliedBiosystems 的 GeneAmp5700 测序系统或 ABIPRISM7000、7700/7900 HT 测序系统或 RocheAppliedScienceLightCycler
5. 其他
MicroAmp 反应管（AppliedBiosystems) 或类似产品
二、方法
1.RNA 分离
制备高质量的 RNA 极为重要，对此市场上有许多商业化产品以及详细的方法可用
(DieffenbachandDveksler1995;Farrell1998;SambrookandRussell2001; 第 10 章）。
2.RT 和 PCR 扩增的组合
(1) 有 dTTP 而无 UNG 下进行的反应
①解冻所有试剂，轻微振荡，避免产生泡沫。
②在微型离心机中将酶和试剂甩至管底，置冰上。
③混合下列试剂（注意：黑体字项目在有 dUTP 和 UNG 时浓度是不同的）。
④轻微振荡上述混合物，加 1.00ulRNA(至 1ug，见 16.1 疑难解答和技巧），轻微振荡整个反应混合物。可以使用任何比例的去除 RNA 酶的水和 RNA 的混合物，只要主要混合物和 RNA 的总体积等于 50ul。
⑤在 GeneAmpPCRSystem9700/2700 上按下列程序进行反应。
65°C，保持 30 min(反转录）
95°C，保持 lmin
95°C，15s;65°C，30s, 进行 40 个循环（PCR 扩增）
65°C, 保持 7 min
⑥反应物可直接用于分析或于-20°C 储存。
(2) 使用 dUTP 和 UNG 进行反应（针对污染控制系统和 UNG 介导的热启动）
①解冻所有试剂，轻微振荡，避免产生泡沫。
②在微型离心机中将酶和试剂离心到管底，置冰上，
③混合下列试剂（注意：黑体字项目在进行有 dTTP 和无 UNG 反应时使用不同浓度）。
④轻微振荡上述混合物，加 1.00ulRNA(至 1ul; 见 16.1 疑难解答和技巧），轻微振荡整个反应混合物。可以使用任何比例的去除 RNA 酶的水和 RNA 的混合物，只要主要混合物和 RNA 的总体积等于 50ul。
⑤在 GeneAmpPCRSystem9700/2700 上按下列程序进行反应。
50°C, 保持 2 min(UNG 步骤)
65°C，保持 30 min(反转录步骤）
95°C，保持 lmin
95°C,15s;65°C，30s, 进行 40 个循环（PCR 扩增）
65°C，保持 7 min
⑥反应物可直接用于分析，为使 UNG 失活，可于-20°C：储存或进行化学处理（如用等体积的氯仿进行抽提），因 UNG 长期存在会破坏扩增产物。反应物可长期储存于-20°C：。UNG 在分析之前不需要进行失活，然而在室溫或者低于 55°C 时它能破坏反应中的复制子。
3. 反应产物分析
为检测扩增产物，可用含 0.5ug/ml 溴化乙锭（EB) 的 2% 琼脂糖进行电泳，也可用实时定量 PCR 的 TaqMan 技术（Mengetal.2001)。用 EB(HiguchiandWaston1999;KangandHolland1999;Kangetal.2000;Holland2002) 或 SYBRGreenI(Baranzinietal.2000) 染色，通过 EB 或 SYBRGreenI 结合反应产物双链 DNA 发出的荧光来检测。当使用 SYBRGreenI 时，浓度控制非常重要，20 倍母液存于 100%DMSO(20 倍母液指 500 倍 SYBRGreenI 存于 DMSO 溶液），使用的最终浓度为 0.2 倍，高于该浓度据证实会抑制 RT 反应的许多酶的活性。
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