RNA的变性琼脂糖凝胶电泳实验原理、材料和操作步骤

一、实验目的

　　学习RNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术。

　　二、实验原理

　　RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。

　　判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。

　　三、材料、试剂及器具

　　1、 材料

　　总RNA提取物。

　　2、 试剂

　　（1）0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。

　　（2）10x电泳缓冲液。

　　吗啉代丙烷磺酸（MOPS） 0.4mol/L（pH 7.0）

　　NaAc 0.1mol/L

　　乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L

　　（3）50mL变性琼脂糖凝胶（1%）

　　（4）10x电泳缓冲液 5 mL

　　琼脂糖 0.5 g

　　0.1%DEPC水 36.5 mL

　　加热溶解，稍冷却，加入8.5 mL 37%甲醛。

　　（5）上样缓冲液：50%甘油，1mmmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。

　　（6）甲酰胺（去离子）。

　　3、器具

　　（1）电泳系统

　　（2）紫外透视仪

　　四、操作步骤

　　1、 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。

　　2、 制胶：

　　称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。

　　3、 加样：

　　在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：电泳缓冲液（10x）2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。

　　4、 电泳：

　　打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳。

　　5、 电泳结束后通过紫外透视仪观察。

　　五、注意事项

　　本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。