Northern 印迹技术
简介印迹杂交是指将待测核酸片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中的标记探针进行杂交的过程。Northern 印迹技术（Northern blot）是分
简介
印迹杂交是指将待测核酸片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中的标记探针进行杂交的过程。Northern 印迹技术（Northern blot）是分析 RNA 的一种方法，因与 Southern 印迹技术对应而被趣称为此。该技术可定量分析某一特异基因转录的强度，根据其迁移的位置也可判断基因转录产物的大小。该技术常用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究。
原理
Northern 印迹技术的基本原理是首先将 RNA 样品通过变性琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到尼龙膜等固相载体上，通过用放射性同位素标记特异的 DNA 或 RNA 探针，与具有特异碱基序列的单链 RNA 进行杂交，去除非特异性杂交信号后经放射自显影，对杂交信号进行分析，可鉴定特异 RNA 分子的含量及大小。
用途
Northern 印迹技术可用于基因表达调控、基因结构与功能、遗传变异及病理研究等。
材料与仪器
器材：
① 电泳仪、电泳槽、制胶模、梳板、玻璃板、托盘
② 紫外分光光度计、紫外检测仪
③ 离心机、恒温水浴箱、真空烤箱
④ 硝酸纤维素滤膜、Whatman 3 MM 滤纸、吸印纸、保鲜膜、杂交袋
⑤ 微量移液器（20μl）、枪头（灭菌）、1.5 ml Eppendorf 管（灭菌）
⑥ 放射自显影盒、X 线胶片
试剂：
① 材料：RNA、已标记好的探针
② 37％ 甲醛、5x 甲醛电泳缓冲液、甲醛凝胶加样缓冲液
③ EB 溶液
④ RNA 分子质量标准（Marker）
⑤ 20xSSC、6xSSC、2xSSC 和 0.1xSSC、50xDenhardt's 溶液
⑥ 0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）、灭菌水
⑦ 预杂交溶液
⑧ 0.1％SDS
⑨ 无水乙醇、TE、灭菌水
步骤
Northern 印迹的基本过程可分为如下几步：
（一）试剂配制
（1）0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）。
（2）5x 甲醛电泳缓冲液 700 ml 经 DEPC 处理的灭菌水溶解 20.9 g MOPS［3-（N-吗啉代）丙磺酸］，用 2 mol／L NaOH 调节溶液的 pH 值至 7.0。加 10 ml 经 DEPC 处理的 1 mol／LCH3COONa 溶液和 10 ml 经 DEPC 处理的 0.5 mol／L EDTA（pH8.0），用 0.1％ DEPC 处理 的灭菌水定容至 1 L，过滤除菌，室温避光保存。终浓度为 0.1 mol／L MOPS（pH 7.0），10 mmol/L CH3COONa,5 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
（3）EB 溶液 0.5 μg／ml EB，0.1mol／L 乙酸铵。
（4）甲醛凝胶加样缓冲液 0.25％ 溴酚蓝，0.25％ 二甲苯青，50％ 甘油，1 mmol／LEDTA（pH 8.0），用 0.1％DEPC 37℃ 处理过夜，高压灭菌，常温保存。
（5）37％ 甲醛 12.3mol／L，pH 大于 4.0。
（6）20xSSC 800 ml H2O 溶解 175.3 g NaCl、88.2 g 柠檬酸钠，14 mol／L HCI 调节 pH 至 7.0，用 H2O 定容至 1 L，终浓度为 3 mol／L NaCl、0.3 mol／L 柠檬酸钠。
（7）6xSSC、2xSSC 和 0.1xSSC 用 20xSSC 稀释。
（8）50xDenhardt's 溶液 1％ Ficoll-400,1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮），1％ BSA（牛血清白蛋白），过滤除菌后于 -20 ℃ 贮存。
（9）预杂交溶液 6xSSC，5xDenhardt's 溶液，0.5％ SDS，100 mg／ml 鲑鱼精子 DNA，50％ 甲酰胺。
（10）杂交溶液 预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。
（11）20％ SDS 900 ml H2O 溶解 200 g SDS（加热到 68℃ 并用磁力搅拌器搅拌有助于溶解），浓 HCl 调节 pH 至 7.2，用 H2O 定容至 1 L，室温保存。使用时按比例稀释。
（二）甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
（1）电泳槽用去污剂洗干净，蒸馏水冲洗，无水乙醇漂洗干燥，3％H2O2 处理 10 min，最后用 DEPC 处理过的三蒸水彻底冲洗，以去除电泳槽内的 RNA 酶。
（2）将 1.5 g 琼脂糖加热溶于 62 ml DEPC 处理的灭菌水中，冷却至 60 ℃，加入 20 ml 5x 甲醛电泳缓冲液和 18 ml 甲醛至终浓度分别为 1x 及 2.2 mol／L。在化学通风橱内，将融化的凝胶倒入制胶模中，梳板置于一端，底部与制胶模之间留下 0.5～1 mm 间隔，凝胶厚度在 3～5 mm。
（3）待凝胶凝固后，将制胶模放入电泳槽内，并向其中加入 1x 甲醛电泳缓冲液，液面高出凝胶表面 1～2 mm，小心拔出梳板。
（4）在 1.5 ml Eppendorf 管内，混合下列试剂：制备样品 RNA 2 μl（20 μg），5x 甲醛电泳缓冲液 4 μl，37％ 甲醛 3.5 μl，甲酰胺 10 μl，总体积为 20 μl。
（5）将上述样品混匀，65℃ 孵育 15 min，迅速冰浴冷却，离心 5s，使管内所有液体集中在管底。加 2 μl 甲醛凝胶加样缓冲液混合待用。
（6）加样前，将制备好的凝胶先预电泳 5 min。随后将样品加至凝胶的加样孔中，并在凝胶最外侧加样孔中加入 RNA 分子质量标准。
（7）接通电源线，样品孔处于电泳槽的阴极端，开启电源开关。调整电压为 3～4 V／cm。每 1～2 h 将正负极电泳槽内液体混合 1 次。
（8）电泳结束后，切下 RNA 分子质量标准所在的凝胶条带，浸入 EB 溶液中染色 30～45 min。在紫外灯下，观察 RNA 电泳条带的迁移距离，照相记录。
（三）转移
（1）切除无用的凝胶部分，在加样孔一侧切去一角，作凝胶方位标记。
（2）将凝胶用经 DEPC 处理的水漂洗数次，以去除所含的甲醛。
（3）裁 1 张硝酸纤维素膜，2～4 张 3 MM 滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。将硝酸纤维素膜剪下一角做相应的方位记号。然后先用无菌水完全湿透，再用 20xSSC 浸泡。接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴橡胶手套操作。
（4）在转移盘中放一块比胶大的平板，上面铺一张 3 MM 滤纸，滤纸两边浸泡在 20xSSC 缓冲液中。去除滤纸与平板之间的气泡。
（5）将凝胶放置在滤纸上，使其电泳时向上的一面朝下，去除两层之间出现的气泡。然后将浸湿的硝酸纤维素膜一次准确铺在胶上，对齐。铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。再用 2 张浸过 2xSSC 缓冲液的 3 MM 滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，同样要把气泡赶去。
（6）把一叠干的吸印纸放置在 3 MM 滤纸上，在吸印纸上再放一块玻璃板，加压约 500 g 重物。
（7）转移 上述步骤完毕，开始进行 RNA 转移。通过滤纸的吸附作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将 RNA 吸印到膜上。需持续 6～18 h，期间如果吸印纸过于潮湿，应换新的干燥的吸印纸。
（8）固定转移后，取出硝酸纤维素膜，浸泡在 6xSSC 溶液中 5 min，以去除琼脂糖凝胶碎块。空气干燥膜片，然后在真空烤箱内 80℃ 烘烤 2 h。烘过的膜可在室温下干燥保存，待杂交。
（四）预杂交
（1） 将转移 RNA 的硝酸纤维素膜放入塑料袋内，加入预杂交液（约 200μl／c㎡），前后挤压塑料袋，使硝酸纤维素膜湿透。
（2） 排除袋中的气泡，然后将塑料袋密封，于 42℃ 水浴中孵育 2～4 h，弃去预杂交液。
（五）杂交
向塑料袋中加入杂交液（预杂交液加入标记好的探针即为杂交液），重新将其密封。然后置于 42℃ 水浴中杂交 16～24 h。
（六）漂洗
（1）弃去杂交液，取出硝酸纤维素膜，在室温下，用 2xSSC／0.1％ SDS 溶液漂洗 2 次，每次 15 min。
（2）室温下，用 0.1xSSC／0.1％SDS 溶液漂洗 2 次，每次 15 min。
（3）55℃，用 0.1xSSC／0.1％SDS 溶液漂洗 2 次，每次 30 min。
（七）放射自显影
漂洗后的硝酸纤维素膜，经空气干燥，用保鲜膜包好。然后在暗室中，于胶片盒内在膜两侧各压上 1 张 X 光片，-70 ℃ 放射自显影。时间视杂交强度而定，24 h～10 d 不等。通常曝光 1～2 d 后可见 RNA 谱带。
（八）实验结果及分析
（1）电泳结束后，应在紫外线下仔细观察 RNA 电泳分离效果是否良好、RNA 样品有无降解、RNA 带型是否清晰、有无拖尾及边缘是否模糊等现象。
（2）放射自显影后，观察 X 光片上曝光显示的条带，对照 RNA 分子质量标准条带的迁移距离，即可查出凝胶电泳中相应的 RNA 的位置，从而知道基因转录的 RNA 的大小。利用「自动光密度扫描仪」扫描曝光的条带，计算条带的积分光密度值，以内参照 RNA 条带的积分光密度值为校正值，即可确定不同样品基因转录的表达强度。
注意事项
（1）RNA 易被 RNA 酶降解，因此需要消除外源性 RNA 酶的污染，尽量抑制内源性 RNA 酶的活力。实验所用到的试剂的配制均需用 DEPC 处理（DEPC 终浓度为 1％），玻璃器皿使用前需 200 ℃ 干烤 4 h，塑料器材用含有 0.1％ DEPC 的水于 37 ℃ 浸泡过夜，然后高压灭菌，确保 RNA 酶的降解，并去除器皿上痕量的 DEPC。实验人员必须戴一次性手套及口罩，实验方案环境应清洁干净，创造一个无 RNA 酶的环境。
（2）在凝胶中不能加 EB，因它会影响 RNA 与硝酸纤维素膜的结合，为测定片段大小，可在同一块胶上加分子质量标准一同电泳，之后将分子质量标准所在的条带切下，染色、照相。样品胶则进行 Northern 转印。EB 是一种诱变剂，皮肤长期接触易发生皮肤癌。因此在操作 EB 时应戴上聚乙烯手套防护。
（3）如果琼脂糖浓度高于 1％，或凝胶厚度大于 0.5 cm，或待分析的 RNA 大于 2.5 kb，需用 0.05 mol／L NaOH 浸泡凝胶 20 min，部分水解 RNA 并提高转移效率。浸泡后用经 DEPC 处理的水淋洗凝胶，并用 20xSSC 浸泡凝胶 45 min。然后再转移到硝酸纤维素膜上。
（4）操作凝胶及硝酸纤维素膜时，要戴上棉布手套，以防止脏物和油脂污染，导致转移失败。
（5）不能使硝酸纤维素膜上的滤纸接触到凝胶下的滤纸，否则形成短路流动使转移均。可用保鲜膜将凝胶缘封围。
（6）将硝酸纤维素膜铺在凝胶上时，膜一经与凝胶接触即不可再移动。因为从接触的一刻起，转移就已经开始。
（7）杂交时，不要留过多面积，浪费预杂交液及杂交液，同时塑料袋内不要留有气泡，否则预杂交及杂交都不均匀。
（8） 孵育前，检查塑料袋是否密闭，勿使袋内液体流出，以及水浴箱内液体流入。
（9） 漂洗强度可根据所杂交的分子大小、同源区段的大小来确定，可适当调节漂洗液强度（改变离子强度）、漂洗温度和漂洗时间，同时亦可用放射性测定仪检测漂洗情况。
（10） 在杂交及放射自显影过程中，应戴上手套防护。杂交了同位素的膜片用保鲜膜包裹好，不要污染其他器皿。
（11） 如果硝酸纤维素膜在杂交后的保存过程中干燥，探针将与膜不可逆性结合，不能再洗脱下来。因此，在漂洗、放射自显影和保存过程中，均应保持其湿润，并密封在塑料袋中。
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