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RNA实验

凝胶阻滞实验分析RNA-蛋白质作用常数实验

2024-06-14 RNA实验 加入收藏
原理凝胶阻滞实验(gel reiardadon assay,又称为 mobthty shift assay)方法简单、灵敏,可以定量的特性使它在研究转录和基因调


原理

凝胶阻滞实验(gel reiardadon assay,又称为 mobthty shift assay)方法简单、灵敏,可以定量的特性使它在研究转录和基因调控中广泛的应用。目前通常用于 RNA ( 或 DNA ) 结合蛋白的纯化,确定一种已知或可能的 RNA 结合蛋白所识别的序列,建立反应常数(如亲和常数和解离常数)等。

材料与仪器

待分析蛋白质 RNA
结合缓冲液 电泳储存液
电泳仪 电泳槽 玻璃板 垫片 梳子 聚丙烯酰胺凝胶电泳 X 射线片 暗盒 放射物质剂量计

步骤

一、材料与设备

1. 标记 RNA 片段、未标记的同种 RNA。

2. 待分析蛋白质。

3. DEPC 处理的水。

4. 10X 结合缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5),500 mmol/L KCl,50 mmol/L MgCl2,10 mmol/L 二硫苏糖醇,10% 甘油,1 mg/ml 牛血凊白蛋白。2X 此缓冲液的储存液也可以选择使用。

5. 釆用标准的电泳仪、电泳槽、玻璃板、垫片和梳子进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

6. 电泳储存液和试剂:40% 丙烯酰胺,2% 甲叉双丙烯酰胺,80% 甘油,4X Tris 甘油缓冲液(1X 缓冲液为 25 mmol/L 的 Tris 碱,0.2 mol/L 的甘油),过硫酸铵,TEMED。

7. X 射线片、暗盒、相应的放射物质剂量计。

二、操作方法

1. RNA 和蛋白的结合反应

(1) 冰浴,微量离心管中加入下列试剂,并混匀:末端标记的 RNA 片段 1 ng,10X 结合缓冲液 2 μl,末标记的同种 RNA 适量,待测蛋白 适量,加水至 20 μl。

(2) 37°C 温育反应液 30 min,温度和时间需要通过经验确定,对于大多数反应,30 min 足够达到平衡。

2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1) 凝胶可以提前制备。用水和乙醇彻底淸洗玻璃板,使用 0.7 mm 薄垫片,12 齿梳子,每齿的尺寸为 0.8 cm X 1.5 cm,玻璃板的尺寸为 18 cm X 23 cm。

(2) 混合适当的储存液得到 40 ml 的溶液,含有 6% 丙烯酰胺、0.12% 甲叉双丙烯酰胺、25 mmol/L Tris 碱,0.2 mol/L 甘氨酸、5%甘油,加入 15 mg 过硫酸铵和 TEMED,灌注到两玻璃板之间,插入梳子,深度为 1~1.2 cm,等到完全聚合,在最后的电泳温度平衡凝胶。

(3) 去掉底部的垫片,将凝胶装到电泳槽,在顶部和底部槽中加入电泳缓冲液(25 mmol/L Tris 碱和 0.2 mol/L 甘氨酸),用吸管吹打毎个孔确保孔中的凝胶底部任何空间的气泡被去除,在上样以前 300V 预电泳凝胶不少于 30 min。

(4) 上样,300V 电泳 3 h。

(5) 倒空电泳槽,取下凝胶。所有的放射性物质,包括 RNA 标记反应时未结合的核苷三磷酸仍然留在凝胶中,底部槽中的缓冲液应该没有放射性,但是任何试验参数发生了改变,必须测定底部糟中的缓冲液有没有放射性(在任何情况下此操作都很有必要)。去掉一个玻璃板,依据定量的方法不同,凝胶可以置于 Whatman 滤纸上在凝胶干燥器中干燥,固定(12% 甲醇,10% 的乙酸)或直接用塑料膜包裹湿的凝胶直接进行定量。

3. 结果的定量

确定各个条带中对应的游离 RNA 和结合 RNA 放射性物质的量,方法有以下几种:

(1) 放射自显影和光密度测量法。湿的或者是干燥的凝胶都可进行 X 射线片显影,放射自显影的结果可以采用光密度扫描进行分析,该方法最大的缺点是 X 射线片定量本身固有的低线性反应范围可导致定量的巨大误差,如果使用此方法,必须建立一个标准的 曲线将光密度单位转换为放射物质的计量单位,以减少 X 射线片非线性反应带来的误差。

(2) 湿的凝胶可以直接进行 X 射线片的曝光,随后进行凝胶上条带的定位,这些条带可以切下来在液体闪烁计数仪上记数。该方法尽管可以避免 X 射线片光密度非线性问题,但是比较烦琐,而且在切胶时容易产生误差。

(3) 感光成像分析技术。干燥的凝胶可以曝光磷屏,然后使用商品化的感光成像仪和相应的分析软件进行处理和分析,该方法准确,优于前面所述的方法。

(4) 直接检测 β 粒子放射。从凝胶上直接检测 β 粒子放射的仪器可从公司购买(Amibis/Scanalytic 公司,BetaScope 公司和 Packard 公司),这些仪器的分辨率通常没有感光成像分析技术高,但是可以满足凝胶阻滞试验的数据分析,通常只需要短时间扫描就可以完成凝胶上标记 RNA 的定量。

无论使用哪种方法定量,最终的结果必须能够代表结合或者游离 RNA 中放射物质的量,只要与试验相适应可以使用任意单位。在电泳时可能会发生 RNA-蛋白复合物分离情况,造成在低迁移率的复合物前面有放射性物质的弥散,这些弥散的放射性物质应该计算到 RNA-蛋白复合物里。


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