凝胶阻滞实验分析RNA-蛋白质作用常数实验
原理凝胶阻滞实验（gel reiardadon assay，又称为 mobthty shift assay）方法简单、灵敏，可以定量的特性使它在研究转录和基因调
原理
凝胶阻滞实验（gel reiardadon assay，又称为 mobthty shift assay）方法简单、灵敏，可以定量的特性使它在研究转录和基因调控中广泛的应用。目前通常用于 RNA ( 或 DNA ) 结合蛋白的纯化，确定一种已知或可能的 RNA 结合蛋白所识别的序列，建立反应常数（如亲和常数和解离常数）等。
材料与仪器
待分析蛋白质 RNA
结合缓冲液 电泳储存液
电泳仪 电泳槽 玻璃板 垫片 梳子 聚丙烯酰胺凝胶电泳 X 射线片 暗盒 放射物质剂量计
结合缓冲液 电泳储存液
电泳仪 电泳槽 玻璃板 垫片 梳子 聚丙烯酰胺凝胶电泳 X 射线片 暗盒 放射物质剂量计
步骤
一、材料与设备
1. 标记 RNA 片段、未标记的同种 RNA。
2. 待分析蛋白质。
3. DEPC 处理的水。
4. 10X 结合缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇，10% 甘油，1 mg/ml 牛血凊白蛋白。2X 此缓冲液的储存液也可以选择使用。
5. 釆用标准的电泳仪、电泳槽、玻璃板、垫片和梳子进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6. 电泳储存液和试剂：40% 丙烯酰胺，2% 甲叉双丙烯酰胺，80% 甘油，4X Tris 甘油缓冲液（1X 缓冲液为 25 mmol/L 的 Tris 碱，0.2 mol/L 的甘油），过硫酸铵，TEMED。
7. X 射线片、暗盒、相应的放射物质剂量计。
二、操作方法
1. RNA 和蛋白的结合反应
(1) 冰浴，微量离心管中加入下列试剂，并混匀：末端标记的 RNA 片段 1 ng，10X 结合缓冲液 2 μl，末标记的同种 RNA 适量，待测蛋白 适量，加水至 20 μl。
(2) 37°C 温育反应液 30 min，温度和时间需要通过经验确定，对于大多数反应，30 min 足够达到平衡。
2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1) 凝胶可以提前制备。用水和乙醇彻底淸洗玻璃板，使用 0.7 mm 薄垫片，12 齿梳子，每齿的尺寸为 0.8 cm X 1.5 cm，玻璃板的尺寸为 18 cm X 23 cm。
(2) 混合适当的储存液得到 40 ml 的溶液，含有 6% 丙烯酰胺、0.12% 甲叉双丙烯酰胺、25 mmol/L Tris 碱，0.2 mol/L 甘氨酸、5%甘油，加入 15 mg 过硫酸铵和 TEMED，灌注到两玻璃板之间，插入梳子，深度为 1~1.2 cm，等到完全聚合，在最后的电泳温度平衡凝胶。
(3) 去掉底部的垫片，将凝胶装到电泳槽，在顶部和底部槽中加入电泳缓冲液（25 mmol/L Tris 碱和 0.2 mol/L 甘氨酸），用吸管吹打毎个孔确保孔中的凝胶底部任何空间的气泡被去除，在上样以前 300V 预电泳凝胶不少于 30 min。
(4) 上样，300V 电泳 3 h。
(5) 倒空电泳槽，取下凝胶。所有的放射性物质，包括 RNA 标记反应时未结合的核苷三磷酸仍然留在凝胶中，底部槽中的缓冲液应该没有放射性，但是任何试验参数发生了改变，必须测定底部糟中的缓冲液有没有放射性（在任何情况下此操作都很有必要）。去掉一个玻璃板，依据定量的方法不同，凝胶可以置于 Whatman 滤纸上在凝胶干燥器中干燥，固定（12% 甲醇，10% 的乙酸）或直接用塑料膜包裹湿的凝胶直接进行定量。
3. 结果的定量
确定各个条带中对应的游离 RNA 和结合 RNA 放射性物质的量，方法有以下几种：
(1) 放射自显影和光密度测量法。湿的或者是干燥的凝胶都可进行 X 射线片显影，放射自显影的结果可以采用光密度扫描进行分析，该方法最大的缺点是 X 射线片定量本身固有的低线性反应范围可导致定量的巨大误差，如果使用此方法，必须建立一个标准的 曲线将光密度单位转换为放射物质的计量单位，以减少 X 射线片非线性反应带来的误差。
(2) 湿的凝胶可以直接进行 X 射线片的曝光，随后进行凝胶上条带的定位，这些条带可以切下来在液体闪烁计数仪上记数。该方法尽管可以避免 X 射线片光密度非线性问题，但是比较烦琐，而且在切胶时容易产生误差。
(3) 感光成像分析技术。干燥的凝胶可以曝光磷屏，然后使用商品化的感光成像仪和相应的分析软件进行处理和分析，该方法准确，优于前面所述的方法。
(4) 直接检测 β 粒子放射。从凝胶上直接检测 β 粒子放射的仪器可从公司购买（Amibis/Scanalytic 公司，BetaScope 公司和 Packard 公司），这些仪器的分辨率通常没有感光成像分析技术高，但是可以满足凝胶阻滞试验的数据分析，通常只需要短时间扫描就可以完成凝胶上标记 RNA 的定量。
无论使用哪种方法定量，最终的结果必须能够代表结合或者游离 RNA 中放射物质的量，只要与试验相适应可以使用任意单位。在电泳时可能会发生 RNA-蛋白复合物分离情况，造成在低迁移率的复合物前面有放射性物质的弥散，这些弥散的放射性物质应该计算到 RNA-蛋白复合物里。
1. 标记 RNA 片段、未标记的同种 RNA。
2. 待分析蛋白质。
3. DEPC 处理的水。
4. 10X 结合缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇，10% 甘油，1 mg/ml 牛血凊白蛋白。2X 此缓冲液的储存液也可以选择使用。
5. 釆用标准的电泳仪、电泳槽、玻璃板、垫片和梳子进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6. 电泳储存液和试剂：40% 丙烯酰胺，2% 甲叉双丙烯酰胺，80% 甘油，4X Tris 甘油缓冲液（1X 缓冲液为 25 mmol/L 的 Tris 碱，0.2 mol/L 的甘油），过硫酸铵，TEMED。
7. X 射线片、暗盒、相应的放射物质剂量计。
二、操作方法
1. RNA 和蛋白的结合反应
(1) 冰浴，微量离心管中加入下列试剂，并混匀：末端标记的 RNA 片段 1 ng，10X 结合缓冲液 2 μl，末标记的同种 RNA 适量，待测蛋白 适量，加水至 20 μl。
(2) 37°C 温育反应液 30 min，温度和时间需要通过经验确定，对于大多数反应，30 min 足够达到平衡。
2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1) 凝胶可以提前制备。用水和乙醇彻底淸洗玻璃板，使用 0.7 mm 薄垫片，12 齿梳子，每齿的尺寸为 0.8 cm X 1.5 cm，玻璃板的尺寸为 18 cm X 23 cm。
(2) 混合适当的储存液得到 40 ml 的溶液，含有 6% 丙烯酰胺、0.12% 甲叉双丙烯酰胺、25 mmol/L Tris 碱，0.2 mol/L 甘氨酸、5%甘油，加入 15 mg 过硫酸铵和 TEMED，灌注到两玻璃板之间，插入梳子，深度为 1~1.2 cm，等到完全聚合，在最后的电泳温度平衡凝胶。
(3) 去掉底部的垫片，将凝胶装到电泳槽，在顶部和底部槽中加入电泳缓冲液（25 mmol/L Tris 碱和 0.2 mol/L 甘氨酸），用吸管吹打毎个孔确保孔中的凝胶底部任何空间的气泡被去除，在上样以前 300V 预电泳凝胶不少于 30 min。
(4) 上样，300V 电泳 3 h。
(5) 倒空电泳槽，取下凝胶。所有的放射性物质，包括 RNA 标记反应时未结合的核苷三磷酸仍然留在凝胶中，底部槽中的缓冲液应该没有放射性，但是任何试验参数发生了改变，必须测定底部糟中的缓冲液有没有放射性（在任何情况下此操作都很有必要）。去掉一个玻璃板，依据定量的方法不同，凝胶可以置于 Whatman 滤纸上在凝胶干燥器中干燥，固定（12% 甲醇，10% 的乙酸）或直接用塑料膜包裹湿的凝胶直接进行定量。
3. 结果的定量
确定各个条带中对应的游离 RNA 和结合 RNA 放射性物质的量，方法有以下几种：
(1) 放射自显影和光密度测量法。湿的或者是干燥的凝胶都可进行 X 射线片显影，放射自显影的结果可以采用光密度扫描进行分析，该方法最大的缺点是 X 射线片定量本身固有的低线性反应范围可导致定量的巨大误差，如果使用此方法，必须建立一个标准的 曲线将光密度单位转换为放射物质的计量单位，以减少 X 射线片非线性反应带来的误差。
(2) 湿的凝胶可以直接进行 X 射线片的曝光，随后进行凝胶上条带的定位，这些条带可以切下来在液体闪烁计数仪上记数。该方法尽管可以避免 X 射线片光密度非线性问题，但是比较烦琐，而且在切胶时容易产生误差。
(3) 感光成像分析技术。干燥的凝胶可以曝光磷屏，然后使用商品化的感光成像仪和相应的分析软件进行处理和分析，该方法准确，优于前面所述的方法。
(4) 直接检测 β 粒子放射。从凝胶上直接检测 β 粒子放射的仪器可从公司购买（Amibis/Scanalytic 公司，BetaScope 公司和 Packard 公司），这些仪器的分辨率通常没有感光成像分析技术高，但是可以满足凝胶阻滞试验的数据分析，通常只需要短时间扫描就可以完成凝胶上标记 RNA 的定量。
无论使用哪种方法定量，最终的结果必须能够代表结合或者游离 RNA 中放射物质的量，只要与试验相适应可以使用任意单位。在电泳时可能会发生 RNA-蛋白复合物分离情况，造成在低迁移率的复合物前面有放射性物质的弥散，这些弥散的放射性物质应该计算到 RNA-蛋白复合物里。
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