总 RNA 提取实验(组织中 RNA 提取与检测)

与从细胞中提取 RNA 的原理类似，在组织块中也是通过 Trizol 来提取 RNA的。通常组织块较大、较紧密，Trizol 难以快速的破坏组织块，所以需要先将组织块研磨。再加入 Trizol，能破坏细胞和溶解细胞成分，利用氯仿的萃取得到上层水相（含 RNA）、界面层和下层的红色有机相（含 DNA 和蛋白）。得到的水层用异丙醇沉淀并经过酒精的洗涤去除杂质，能分离大小不一的各种RNA。

通过 RT-PCR 检测某组织中基因的表达情况。

材料：组织块；Trizol 试剂；氯仿；异丙醇；75％ 乙醇（使用 RNase-Free 水配制）；RNase-Free 水；液氮。

物品及仪器：1.5 ml EP 管（RNA-free）；大、中、小号枪头（RNA-free）；移液器；涡旋振荡器；高速冷冻离心机；超净工作台；匀浆机或研磨棒。

1.用组织剪将组织切成 1-3mm 的小块，放入 1.5mL ep 管中，加入 0.5-1 mL Trizol 裂解液（对于一些较硬的组织建议用液氮磨碎），用研磨棒将组织杵碎至看不见组织块（也可以用匀浆机，但是要注意清洗探头）。

2.往上述 ep 管中加入 1/5 Trizol 体积的氯仿，剧烈震荡充分混合后，室温静置 10 分钟，使核酸蛋白复合物完全解离。

3.在 ４℃ 下 12000g 离心 15 分钟。

5.离心后，将上层水相（约 1/2 Trizol 体积）小心转移到一个新的 EP 管，加入等体积异丙醇，震荡后室温静置 5-10 分钟，然后 12000g 4℃ 离心 15 分钟，弃上清保留沉淀。

6.加入 1mL75％ 乙醇清洗并沉淀 RNA，12000g 离心 10 分钟。

7.弃上清，并重复上述操作一次，

8.弃上清，在超净工作台中打开 ep 管盖，风干 5-10 分钟，不需完全干燥。

9.视沉淀的量，加入 10-30 µL RNase-Free 的 DEPC 双蒸水中。

10.待沉淀溶解后，用 nanodrop 测定其浓度和纯度并作标记，进行下游实验，多余的 RNA 保存于 -80℃ 冰箱。

1.为避免研磨棒带来的 RNA 酶污染，应将研磨棒用 DEPC 水清洗并高压处理。

2.过程中需佩戴口罩和新手套，对台面以及周围环境进行灭酶处理，尽量在超净台中进行操作。

3.使用无 Rnase 的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

4.溶液配制应使用无 Rnase 的水，（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度为 0.1%（V/V),放置过夜，高压灭菌。注：DEPC 有致癌之嫌，须小心操作）。

5.Trizol 裂解液非常危险，因小心避免溅到身上，台面上的 Trizol 要及时清理干净。

一、RNA 质量不高
1.取上层水相时求多，吸到了下层有机相；
2.清洗不干净。

二、RNA 样品中 DNA 污染
1.现在很多商品化的反转录试剂中都有 DNA 酶，能有效的去除基因组 DNA；
2.取样时吸到有机相。

三、RNA 发生降解
1.耗材的污染，换用新的耗材；
2.环境污染，现在市面上有 RNA 酶清洗剂的出售；
3.裂解液不足。