总 RNA 提取实验(一步法)

1.  组织来源材料：100 ng 组织加1 ul 变性液，在玻璃Teflon匀浆器中将其匀浆。

2.  培养细胞：离心弃悬浮细胞培养液或倒去单层培养细胞培养液（不需用生理盐水洗涤），每107细胞加入1 ml 变性液，然后用吸管抽吸7~10次。

 

3.  将匀浆移入5 ml 聚丙烯管子，加入0.1体积的2 mol/l pH4.0的乙酸钠缓冲液，混匀。

4.  加入1 ml 水饱和酚，混匀；再加入0.2体积的49：1氯仿/异戊醇。

5.  混匀后0~ 4℃放置15 min。

 

6.  于4℃用SS-34转子10 000 g 离心20 min，将上层水相移入一个干净试管中。

7.  加入1 ml （等体积）异丙醇-20℃放置30 min 沉淀RNA，于4℃ 10 000 g 离心10 min。

 

8.  将RNA溶解于0.3 ml 变性液，并移入1. 5 ml 微量离心管中，加0.3 ml 异丙醇,。

9.  -20℃放置30 min 沉淀，于4℃ 10 000 g 离心10 min。

 

10.  重悬RNA沉淀于75%乙醇，旋起沉淀，室温放置10~15 min，10 000 g 离心5 min。

11.  真空干燥RNA 5~10 min，溶解沉淀于100~200 ul DECP此处理过的水或DEPC处理过的0.5%SDS，-70℃冰冻保存或保存在-20℃的乙醇中。