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RNA实验

TRIzol RNA 提取方法

2024-06-14 RNA实验 加入收藏
原理Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂,采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和 β-巯基乙醇等变性物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于


原理

Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂,采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和 β-巯基乙醇等变性物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏 RNase 蛋白质中的二硫键。细胞裂解后,细胞释放出蛋白质、DNA、RNA 等物质,再根据它们在不同的 PH 值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。

材料与仪器

仪器:细胞样品、TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇、DEPC、H2O
材料:离心管、离心机、EP 管、匀浆器、移液管、冰袋、漩涡振荡器

步骤

1. 样品处理:

(1) 培养细胞:收获细胞 1~5 × 107,移入 1.5 mL 离心管中,加入 1 mL Trizol,混匀,室温静置 5 min。

(2) 组织:取 50~100 mg 组织(新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可)置 1.5 mL 离心管中,加入 1 mL Trizol 充分匀浆,室温静置 5 min。


2. 加入 0.2 mL 氯仿,振荡 15 s,静置 2 min。


3. 4 ℃ 离心,12000 g × 15 min,取上清。


4. 加入 0.5 mL 异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置 10 min。


5. 4 ℃ 离心,12000 g × 10 min,弃上清。


6. 加入 1 mL 75% 乙醇,轻轻洗涤沉淀。4 ℃,7500 g × 5 min,弃上清。


7. 晾干,加入适量的 DEPC H2O 溶解(65 ℃ 促溶 10~15 min)

注意事项

1. 样品量和 Trizol 的加入量一定要按步骤(1)的比例,不能随意增加样品量或减少 Trizol 量,否则会使内源性 RNase 的抑制不完全,导致 RNA 降解。


2. 实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。

常见问题

1. RNA 的定量计算:


RNA 定量方法与 DNA 定量相似,RNA 在 260 nm 波长处有最大的吸收峰。因此,可以用 260 nm 波长分光测定 RNA 浓度,OD 值为 1 相当于大约 40 μg/mL 的单链 RNA。如用 1 cm 光径,用 ddH2O 稀释 DNA 样品 n 倍并以 ddH2O 为空白对照,根据此时读出的 OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/mL) = 40 × OD260 读数 × 稀释倍数(n) / 1000。

  
2. RNA 的纯度:
RNA 纯品的 OD260/OD280 的比值为 2.0,故根据 OD260/OD280 的比值可以估计 RNA 的纯度。


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