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RNA实验

乙型脑炎病毒 RNA 提取

2024-06-20 RNA实验 加入收藏
材料与仪器酚 氯仿 异戊醇 乙醚 KAc 乙醇 DEPC 处理水 TBE 缓冲液 上样液 KCI。透析袋步骤一 材料与设备1) 酚:氯仿:异戊醇 (25:24:


材料与仪器

酚 氯仿 异戊醇 乙醚 KAc 乙醇 DEPC 处理水 TBE 缓冲液 上样液 KCI。
透析袋

步骤

一 材料与设备

1) 酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1),

2) 乙醚

3)2.5mol/LKAc

4) 乙醇

5)DEPC 处理水

6)TBE 缓冲液

7〕上样液:40% 甘油,0.4% 啡叮溴红的 TBE 溶液

S) 透析袋

9)KCI

二 操作方法

1. 酚:氯仿:异戊酵提取法

1) 蔗糖密度梯度离心纯化的病毒与等体积饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 混合,冰浴中振荡 3〜5 min。

2) 在 4℃ 下,8000 g 离心 lOmin,吸出上层水相,再用同样方法处理第二次,获得的上层水相用乙醚洗涤;二次去酚,水相加 1/10◦体积的 2.5mol/LKAc 及 2 倍体积乙醇,在—20℃ 下保存

2. 琼脂糖凝胶制备电泳纯化法

1) 制备 1.2% 琼脂糖-TBE 凝胶。

2) 在离心去乙醇的 RNA 小管中,加入 40〜80ul 电泳上样液,上样进行电泳。电泳液为 TBE,电 60〜100V, 电泳 3〜6 h

3) 切下含病毒 RMA 区带的凝胶条,装入透析袋,内加 0.5〜2 mlTBE, 袋的两端用线或普通木夹或塑料夹)封口,放在电泳槽中再次进行电泳。约 lh 后 RMA 走出凝胶,吸出袋内 RNA, 加 KC1 至 0.25mol/L,加 2 倍体积乙醇,在一下保存。

3. 乙型脑炎病毒 RNA 纯度检查

1) 乙型脑炎病毒 RNA 感染性的鉴定可用小白鼠脑内滴定来完成,也可以在麦胚无细胞蛋白合成系统中测定其 mRNA 活性。

2) 测定分子质量大小,乙型脑炎病毒 RNA 在琼脂糖凝胶电泳中为单一区带。RNA 大小标记物可用正常动物细胞的 18SRNA 和 28SRNA, 在小白鼠细胞中,这两种 rRNA 的分子质量分别是 0.7X106Da 和 1.65Xl06Da





注意事项

1) 为了获得高滴度病毒,要选择对乙型脑炎病毒敏感的培养细胞。对子 c6/36 培养细胞,病毒繁殖滴度髙,并 R 病毒能对该细胞造成持续感染,细胞病变轻微。病毒感染后,培养 2〜4 天,收获病毒,又可以换上新鲜培养液继续培养,这样就能从一批培养细胞中不断获得含病毒的上清液。

2) 提纯的病毒 RNA 在 -20℃ 乙醇中比较稳定,至少可保存 2 个月。


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