动物组织细胞总RNA的提取

一、实验原理

RNA 是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA 进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern 杂交、cDNA 合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA 的质量。由于细胞内的大部分RNA 是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA 时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA 分离，释放出RNA 。

再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA 与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA 。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase 活性，保护RNA 分子不被降解。因此提取必须在无RNase 的环境中进行。可使用RNase 抑制剂，如DEPC 是RNase 的强抑制剂，常用来抑制外源RNase 活性。提取缓冲液中一般含SDS 、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase 活性。并有助于除去非核酸成分。

本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol 法提取动物组织总RNA 并通过电泳 进行鉴定。

二、仪器和试剂

1. 仪器：

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep 管、玻璃匀浆器、试管、

玻璃器皿洗净后置180 ℃烘烤8h ；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1% DEPC 浸泡2h,70 ～80 ℃烘烤干燥，120 ℃高压20min ，再70 ～80 ℃烘烤干燥方可使用。

2. 试剂：

(1) 细胞裂解液：

异硫氰酸胍 4mol/L

柠檬酸钠（pH7.0 ） 25mmol/L

十二烷基肌氨酸钠 0.5%

β- 巯基乙醇 0.1mol/L

称取柠檬酸钠0.64g ，十二烷基肌氨酸钠0.415g ，吸取β- 巯基乙醇0.7ml ，用无Rnase 的蒸馏水溶解，定容至50ml 。然后取以上配制的溶液(CBS 液)33ml ，异硫氰酸胍 25g, 混合，完全溶解后4 ℃保存备用。

(2)10 ×凝胶缓冲液：

吗啉代丙璜酸（MOPS ）（pH7.0 ） 200mmol/L

NaAc 100mmol/L

EDTA(pH 8.0) 10mmol/L

过滤除菌后避光保存。

（3 ）5 ×变性上样缓冲液：

水饱和的溴酚蓝 16 μl

500mmol/LEDTA(pH 8.0) 80 μl

甲醛（37% ） 720 μl

甘油 2ml

甲酰胺 3084 μl

10 ×凝胶缓冲液 4ml

加无RNase 水至10ml ，4 ℃可保存3 个月。

（4 ）TRIzol RNA 抽提试剂

（5 ）2mol 醋酸钠

（6 ）0.1% DEPC

(7 ) 平衡酚：氯仿：异戊醇（25 ：24 ：1 ）

（8 ）平衡酚、氯仿

（9 ）无水乙醇、70% 乙醇、异丙醇

(10) 无RNase 水

三、操作步骤

（一）异硫氰酸胍法（PLT ）

1. 取新鲜动物组织0.1 ～0.2g 置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml, 在冰浴中迅速匀浆15 ～30s ，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2. 加入2mol 醋酸钠（pH4.0 ）120 μl ，充分混匀。

3. 加入1.2ml 酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s ，冰浴15min 。

4. 将混合物转移至1.5ml Ep 管中，4 ℃，离心10 000r/min,20min.

5. 移取上层水相至另一Ep 管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20 ℃，30min 沉淀RNA.

6. 4℃ ，离心12 000r/min ，15min.

7. 弃上清液，加入70% 乙醇400 μl, 洗涤RNA 沉淀物；如果RNA 沉淀物被悬浮，则4 ℃离心10 000r/min ，10min 。

8. 弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA 难以溶解。

9. 加入100 μl 无RNase 水重悬RNA ，或加1ml 无水乙醇和1/10 体积3mol 醋酸钠（pH4.0 ），?C70 ℃保存。

（二）TRIzol 试剂提取RNA

1. 取新鲜动物组织0.1 ～0.2g 置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol 液 1ml 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15 ～30s ，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep 管中，于室温下静置5min 。

2. 加入200 μl 氯仿，剧烈振摇15s 混匀后，室温静置3min 。

3. 4℃ ，10 000r/min 离心15min ，RNA 分布于水相中。

4. 将上层无色水相转移到另一Ep 管中，加入500 μl 异丙醇，室温静置10min 。

5.4 ℃，10 000r/min 离心10min 。

6. 弃上清液，用1ml 75% 乙醇洗涤RNA 沉淀物，4 ℃，7500r/min 离心5min 。

7. 弃上清液，室温干燥15min.

8. 向干燥过的沉淀物中加入200 μl DEPC 处理水（无核水）溶解沉淀物，于-20 ℃保存备用。

（三）RNA 检测

1. 在紫外分光光度计上检测RNA 浓度及纯度。

方法同实验四，用DEPC 处理水校正零点；用DEPC 处理水稀释RNA 样品；读取OD260 、OD280 值及OD260/OD280 的比值。

2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测

（1 ）制备凝胶（1.2% ）。称1.2g 琼脂糖，加72ml DEPC 处理水，加热熔化。冷却至60 ℃，在通风橱内加入10 ×凝胶缓冲液10ml ，甲醛（37% ）18ml ，混匀后，倒胶。

（2 ）制备样品。在离心管中，将RNA 样品与5 ×变性上样缓冲液以4 ：1 混匀。65 ℃温育5 ～10min ，迅速在冰上冷却5min ，离心数秒。

（3 ）上样前凝胶须预电泳5min ，随后将样品卷入上样孔。以5V/cm 的电压电泳1.5 ～2h. 。

（4 ）待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3 ～4/5 处结束电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液（0.5 μg/ml ，用0.1mol/L 乙酸胺配制）中染色约30min 。

（5 ）在凝胶成像系统观察并分析。

四、注意事项

1.RNA 是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA 必须在无RNase 环境中，戴口罩、手套、使用无RNase 污染的试剂、材料、容器。

2. 所有溶液应加DEPC 至0.05% ～0.1% ，室温处理过夜，然后高压处理或加热至70 ℃ 1 小时或60 ℃过夜，以除去石油残留的DEPC 。

3. 所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA 酶活性。

4. 根据RNA 样品的紫外吸收OD 值，可计算出RNAd 浓度。

单链RNA [ssRNA]=40 ×（OD260-OD310 ）×稀释倍数

纯RNA OD260 / OD280 比值通常在1.7 ～2.0 。若比值低于1.7, 说明有蛋白质等污染，应用酚/ 氯仿在抽提。若比值低于2.0, 表明有盐、胍、糖可用LiCL 选择沉淀RNA 以除去杂质。

5.RNA 样品电泳后，可见28S 、18S 及5S 小分子RNA 条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase. 。28S 和18S RNA 比值约为2 ：1, 表明RNA 无降解。如比值逆转，则表明RNA 降解。电泳中如果在28S 后方还有条带，表明有DNA 污染，应用DNase 处理后再进行纯化。