RNA探针的合成方法和合成效率检测

在RNA的杂交检测实验中，应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果，与DNA 探针相比，检测灵敏度提高10-100倍。因为对于不同的杂交体类型来说，RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。

对于通过Northern blots检测低浓度mRNA，以及原位杂交的核酸定位检测等应用，RNA探针是一种理想选择。RNA探针同样也适用于Southern blots，文库筛选，斑点杂交等应用。但是，在RNA探针制备过程和整个杂交实验过程中，必须注意RNAse的防污染操作。

制备RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒，将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后，进行体外转录的探针合成反应。当然，采用的质粒上必须含有SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。体外转录法合成的探针量很大，通常情况下，1μg的DNA模板进行反应，将得到20μg的标记RNA探针。 另一种更加直接的体外转录标记法，是先通过PCR方法制备DNA探针模板。扩增引物需要特殊设计，包含SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。 对于原位杂交的应用，为了更好地进行杂交反应的质控，建议在制备反义链探针的同时，也制备正义链的探针，用作杂交实验的阴性对照。在原位杂交实验前，首先通过Northern blots实验验证探针的有效性和目标转录子在不同样本中的表达模式，有助于简化后续原位杂交实验的优化流程和结果解释。 模板制备和探针标记 以地高辛（DIG）的探针标记方法为例，罗氏DIG Northern Starter Kit的操作指南中建议，如果直接通过PCR方法制备DNA探针模板，反义链端的反向扩增引物应包括T7 RNA聚合酶的启动子序列5'-AATACGACTCACTATAGG-3'（后续通过T7 RNA转录），或T3启动子序列5'-ATTAACCCTCACTAAAGG-3'（通过T3 RNA转录）。

通过此方法获得的特定PCR产物，无需经过纯化，即可用于下游探针合成。对于地高辛标记系统，在体外转录合成的探针片段中，大约每隔3个UTP位点会插入一个DIG标记的UTP分子（DIG-11-UTP）。

核苷酸混合底物中未标记UTP和DIG-11-UTP的比例很重要，因为在使用地高辛抗体进行含DIG的杂交体的检测时，探针上插入的DIG分子需排布在一个合适的空间位阻范围，以利于抗体的顺利结合，并获得高灵敏度的检测信号。

罗氏DIG Northern Starter Kit中提供理想浓度比例的含DIG-11-UTP的核苷酸混合底物。当实验涉及的反义链探针的AU含量很高时，可通过加入未标记dNTPs的方法，适当调低DIG-11-UTP在核苷酸混合底物中的浓度。 探针标记分析和灵敏度检测 DIG标记的RNA探针可以通过琼脂糖凝胶电泳检测其片段长度和纯度。如未标记的相同RNA序列比较，由于DIG分子的插入，被标记的RNA将会在泳道中呈现分子量的变化。 在进行杂交实验前，检验所合成探针的灵敏度是非常重要的一个步骤，是进行实验优化和获得可重复性杂交结果的前提。过高的探针浓度将引起高杂交背景，过低的探针浓度将使得杂交信号变弱甚至缺失。

通过斑点杂交实验可以验证DIG标记探针的灵敏度。将标记好的探针进行一系列的浓度梯度稀释，点样于阳离子尼龙膜上。同时，DIG Northern Starter Kit中提供有已知浓度的DIG标记的β-actin RNA作为阳性对照。

将样品点样并交联在膜上后，直接进行抗体结合和底物化学发光检测（偶联AP的地高辛抗体和CDP-Star化学发光检测体系，均在试剂盒中提供）。

DIG标记的探针如在0.1pg的稀释点处显色，表明标记探针的灵敏度十分理想。进行杂交实验的探针灵敏度应至少达到1pg稀释点的检出，否则探针的灵敏度不足以获得稳定的杂交研究结果。

启动子序列对探针标记效率的影响 增加启动子序列的长度将对探针标记效率产生影响，获得更高产量的探针（见图3）。如可将T3启动子的序列增长为5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; T7启动子的序列增长为5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'。 罗氏地高辛产品系列广泛应用于核酸标记和杂交检测，具有高度灵敏、标记检测方便和探针可重复使用等特点。地高辛标记的探针可在-15 ~ -25°C稳定保存至少一年的时间。

DIG Northern Starter Kit是为DIG 系统初次使用者设计的试剂盒，试剂盒中包含了获得成功、可重复的杂交检测结果的所有必须试剂。该试剂盒以线性化DNA为模板，通过体外转录过程合成大量RNA转录本，RNA分子合成过程中掺入DIG-11-UTP底物，从而获得DIG标记的RNA探针。

DIG Northern Starter Kit中的DIG Easy Hyb是专为地高辛杂交系统优化的杂交缓冲液。在进行杂交体检测时，应用试剂盒提供的偶联有碱性磷酸酶（AP）的DIG抗体和CDP-Star化学发光底物，在短时间内获得高度灵敏、特异的杂交检测结果。

配合使用DIG Wash and Block Buffer Set，能够避免配制杂交过程中用到的洗涤和封闭缓冲液的麻烦，并有助于提高杂交检测的质量和重复性。 当您对地高辛系统熟悉后，可根据您的研究需求灵活选择地高辛RNA标记反应液（DIG RNA Labeling Mix）和试剂盒（DIG RNA Labeling Kit），及其他检测系统（DIG Luminescent Detection Kit和DIG Nucleic Acid Detection Kit）。