动物总RNA的提取

实验目的   学习从动物组织中提取RNA的原理和方法。 实验原理   RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度变性剂TRIzol，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过氯仿、异丙醇等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 实验 仪器 和材料 低温冷冻离心机、烤箱、制冰机、移液器、冰箱，水平电泳槽、电泳仪、匀浆器、TRIzol、氯仿、异丙醇、75％乙醇（DEPC H 2 O）配制、DEPC H 2 O 实验步骤 1.  取50－100mg（新鲜或－70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml匀浆器中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室温静置5min。 2.  加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 3.  4℃离心，12000g×15min，取上清置另一1.5ml离心管中。 4.  加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 5.  4℃离心，12000g×10min，弃上清。 6.  加入1ml75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃离心，7500g×5min，弃上清。 7.  晾干，加入适量的DEPC H 2 O溶解（65℃促溶10～15min）。 8.  快速电泳检测RNA完整性。 注意事项     1.样品量和TRIzol的加入量一定要按照步骤1的比例，不能随意增加样品量或减少TRIzol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。     2.实验过程中必须严格防止RNase的污染。 3.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 4.塑料器皿可用0.1％DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。 5.配制的溶液应尽可能的用0.1％DEPC在37℃处理12h以上，然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的 试剂 ，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22um滤膜过滤除菌。