RNA 分析的几个热点领域及主要技术路线

DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。基因组织DNA中的基因通过转录为mRNA并进一步翻译为蛋白质，很多种类型的蛋白质在最终发挥功能时又经历磷酸化、糖基化、酶原激活等翻译后修饰。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生命合成物中发挥不可替代的重要功能。因此，mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。目前国内外在mRNA的表达研究上如火如荼，这对于后基因组时代阐明基因的功能至关重要。 但RNA在生命活动中的重要作用远不止如此：很多种类的病毒直接以RNA为遗传信息携带者，如SARS和AIDS等；而很多其它种类的不编码蛋白质的RNA分子在生命活动中起其它重要作用，如大分子生物加工和基因表达调控等。下面简要列举一些重要的RNA分子及其生物学意义： gRNA(导引RNA):mRNA编辑 snRNA(核内小分子RNA):mRNA加工（剪接和成熟） snoRNA(核内小分子RNA):rRNA成熟加工(切割和修饰) RNA P(RNA聚合酶):rRNA加工 Telomerase(端粒)RNA:DNA复制，端粒合成 SRP（信号识别颗粒）－RNA：转运，蛋白分泌 　　tmRNA：破损mRNA蛋白质合成的终止 Lin-4:发育控制反义RNA(antisence RNA for development control) rps14:核糖体生物合成反义RNA(antisence RNA for ribosome biogenesis) dsRNA(双链RAN)：基因沉默(gene silence) Xist(Xi-specific transcript)&其反义RNA Tsix:　X染色体失活 尚有很多RNA的功能还未鉴定，如很多scRNA（细胞质小分子RNA）、用沉降系数命名的7S，10SRN等。一些生物催化剂如核酶也是RNA。 国内中山大学和上海生命科学院等在这些非编码RNA的研究中做了大量工作，在国际上也占有一席之地。 RNA的种类可能还远不止这些，每种RNA的功能也远不止上面提到的那么简单。随着研究的深入，更多种类的RNA和RNA的功能在被诠释。因此生命科学中的一个新的学科RNA的组学(RNomics)正在兴起。 勿容质疑的现实是：在所有种类RNA功能等的研究中，mRNA的表达研究是最主要的热点。特定生物的基因在不同发育阶段、不同生理病理条件、不同细胞类型中的表达不尽相同，了解基因表达的开放与否和表达水平高低对阐明基因的功能至关重要。MRNA表达研究的传统技术如Northern、原位杂交和定量RT-PCR等低通量技术适于少量基因的表达研究。但我们知道：参与任何一个生命过程的基因种类都有很多，因此低通量技术已经不适合大量基因表达的研究，高通量研究基因表达的技术应运而生，在这些技术中，DD-TCR和SSH技术操作复杂，假阳性率很高；因此近二十年来发展起来的DNA微阵列技术尤其是全基因组DNA微阵列技术成为获得基因表达信息的最好技术平台，该技术可以在尽可能短的时间内筛选出参与一个生命过程的所有的基因的表达数据。 DNA微阵列技术主要有两种：cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列。在cDNA微阵列中，每个基因的探针为cDNA或基因的一段PCR产物；这种探针设计策略很难特异区分诸如RNA剪接体、重叠基因和G蛋白偶联受体等同源基因。寡核苷酸微阵列技术又包括两种：约70mer的寡核苷酸微阵列和Affymetrix 25mer寡核苷酸基因芯片(Genechip)。在70mer微阵列中，每个基因的探针为该基因的一段70mer的特异寡核苷酸片段。在Affymetrix基因芯片中，每个基因都有10-20个特异探针(PM探针)，每个探针为 25mer的寡核苷酸片段；每个探针还有对应的错配(MM探针)。探针特异性由大到小的排序为：25mer>70mer>cDNA。因此，Affymetrix基因芯片技术可以保证基因表达检测的最好特异性。由于MM探针可以有效扣除总杂交信号中的背景信号，得到真正的杂交信号，因此Affymetrix基因芯片技术还可以保证基因芯片检测的高灵敏度，这里的高灵敏度指可以检测到低丰度表达的基因，也同时指低丰度表达的基因的表达水平发生变化时可以被检测出来。目前看来，Affymetrix基因芯片技术可以保证基因表达检测的最好特异性、最高灵敏度、最好的重复性可靠性及最好的定量分析。因此Affymetrix基因芯片技术得到的基因表达信息基本没有必要通过定量RT-PCR、原位杂交和 Northern等技术来验证。 当然，Affymetrix基因芯片技术的局限性在于该技术依赖基因组序列信息。如果一个物种的基因组序列信息已知，Affymetrix就可以通过生物信息学等设计代表每一个基因的特异的探针。尽管Affymetrix芯片涉及的物种已经居全球首位(Affymetrix公司目前能提供的芯片物种信息见本刊后面的专题介绍)，由于很多生物没有基因组序列信息，高通量研究这些生物的基因表达信息还只能依赖构建cDNA文库并制作cDNA微阵列，这样得到的基因表达信息需要通过定量RT-PCR、原位杂交和Northern等技术来验证。 基因芯片得到的基因表达数据很丰富，通过生物信息学可以得到其中最具有价值的信息，比如哪些基因可能与研究者研究的生理或病理现象直接相关。对于这些重要基因的功能的研究，下一步的技术包括RNAi，基因敲除和转基因技术等。而基因功能的最终阐明需要结合蛋白质(组)的研究等。 最后需要指出的是，不同细胞类型在不同生理或病理条件下或在不同的发育阶段，其基因表达情况不尽相同，如果采取匀浆技术获得含多种类型细胞的组织中的mRNA并杂交基因芯片，那么得到的数据无法精确解释每一类细胞的基因表达情况。建立细胞类型特异性的基因表达数据对研究生命现象的分子机理很重要，可以通过激光显微切割(laser microdissection,LMD)技术将一个组织中不同类型的细胞进行分离，从不同细胞类型中分别得到各自的Mrna，然后分别杂交基因芯片。那当然，LMD技术对建立细胞特异性的蛋白质表达数据信息也至关重要。

RNA干扰研究前沿和应用领域

小RNA(MicroRNA,miRNA)作用与应用研究继2001，2002连续两年被美国《Science》杂志评为年度10大突破技术以来，2003年继续热度高涨，名列前矛。其核心技术RNA干扰(RNAi ),即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA(siRNA)代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。近两年来，这方面的科学论文及报道爆炸性增长，几乎每天都有新的结果涌现。此外，RNAi沉默机制的探索方面也取得了相当的进展。在大致勾画出生物体内源性小RNA的重要作用框架后，2003年生物学家致力于阐述进一步的细节，探索小RNA如何调控细胞的行为，如何RNAi进行疾病防治等等。以下就分几个方面为大家介绍一些近几年RNA干扰的主要研究领域及前沿进展。 一． 外源RNA诱导RNAi的应用 1. 基因功能研究 从2001年《nature》杂志上首家报道在哺乳动物培养细胞中通siRNA成 功诱导了特异性靶基因表达沉默后，RNA干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具从低等生物成功进军哺乳动物领域。2003年Rubinson DA等又在 Nature Genetics上报道用病毒系统在原代哺乳动物细胞，干细胞和转基因小鼠都取得了RNA干扰成功，更大大扩展了这项技术的应用范围。研究者们可以利用这项技术对目标基因进行特异性的表达沉默，通过观察目标基因表达被抑制后细胞以至生物体从形态到各项生理生化的变化，对该基因的功能及参与的信号网络进行研究。这比起传统的基因敲除方法要简单而且方便很多，因此短短几年，就有了很多突破性的成果。其中研究得最多的是跟疾病相关的一些基因，不仅对疾病机制及相关代谢网络有了进一步认识，也为基因治疗及药物筛选提供了一些借鉴。 在具体诱导方式方面，目前报道的成功的siRNA形式多样，其中短发夹结构RNA(shRNA,short hairpin RNA)表达载体的应用大大加快了研究者从最初的培养细胞水平扩展到成体水平的步伐。例如，在神经生物学研究中，开着车NIH的Backman C等通过siRNA表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺能相关基因进行了有效抑制，Hommel JD等还通过病毒介导的RNAi建立了此类成年小鼠模型，不仅为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记，对神经系统的基因治疗也有一定借鉴意义；在癌症研究中，Zhang Y等也通过shRNA表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因，并对RNAi的远程（穿过血脑屏障）基因沉默方法进行了非常有益的探索凋亡途径，Zender L等通过RNAi抑制凋亡基因Caspase-8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率，并发现Caspase 8 siRNA处理对特异性Fas激活剂(Jo2和ADFasL)和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效，显示了这个动物模型能反应人类急性病毒肝炎的多分子参与的机制，增强了siRNA用于急性肝炎病人治疗的希望…… 除了对某些关键基因的RNAi研究外，Zheng L等还在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法。他们建立了一个包含8000多个基因的siRNA表达框文库阵列，通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的及Unique基因。由此可见，RNA干扰正作为筛选成百甚至上千基因的工具，发挥着越来　越大的作用。 总的来说，RNA干扰为系统地RNA抑制分队合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。通过在一段时间内对一个基因RNA信号的抑制，研究者可以深入研究基因功能，进而开始支配从细胞形态到信号系统的遗传网络。 2. 基因治疗及药物筛选探索 由于RNA干扰是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统的基因治疗对基因水平上的敲除，整修流程设计更简便，且作用迅速，效果明显，为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制，控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。尤其针对引起一些对人类健康严重危害的核酸病毒，如去年全球多个国家和地区浒的SARS这种主体是单链核酸的新型冠状病毒，寻找药物靶点，设计核酸药物就更加方便。目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物，如在去年SARS药物研究中一鸣惊人的美国俄勒冈州的AVIBioPharma生物制药公司等国。国内也有很多研究机构及生物技术投入了这方面的工作。如上海生科院成立了SARS防治科研攻关领导小组，其中生化细胞所和药物所的一些课题组在从RNA干扰的角度努力。此外，北大，中南大学，动物所等大专院校研究机构以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司也开展了RNA干扰药物的研究与开发。 基因治疗方面去年最引人注目的进展之一是对肝炎的RNA干扰研究。McCaffrey　AP等通过表达shRNA的载体在培养细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了HBV复制。与对照相比，小鼠血清中测得的HbsAg下降84.5%，免疫组化对HbcAg的分析结果下降率更超过99%。另，哈佛大学Liberman的研究小组通过注射针对Fas的siRNA，过度激活炎症反应，诱导小鼠肝细胞自身混乱。然后给测试小鼠注入使Fas hyperdrive的抗体，发现未进行siRNA处理的对照组小鼠在几天中死于急性肝功能衰竭，而82%的siRNA处理小鼠都存活下来，没有患病，它们当中80-90%的肝细胞经证实结合了siRNA。并且，RNAi发挥功能达10天，三周后才完全衰退。由于Fas很少在肝细胞外的其它细胞高表达水平，对它的抑制对其它器官几乎没有副作用。此外，这个小组还和其它研究者积极开展针对HIV的RNAi测试，目前报道他们使用的针对CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV进入免疫细胞约三周，在已经感染的细胞中也能阻止感染的病毒复制。 然而，尽管取得了不少成果，要真正用于医疗还需时日。目前大多数还停留在小鼠测试阶段，siRNA的导入采用静脉或腹腔注射，尾部注射，细胞移植等，如何对人进行有效的给药，既要确保药效在靶器官靶组织有效释放，还要具有高度安全性等等尚需进一步研究。我们期待着RNAi引领的新医学革命的到来。 在药物筛选领域，除了线虫这咱低等动物的RNAi高通量药筛模式外，2003年Lavery KS等的综述中也对RNAi在药筛领域的应用前景进行了高度评价：RNAi技术将交逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具。他对如何在药筛的各个阶段应用RNAi做了具体描述及展望，并指出将这项技术与高通量筛选，体外生物检测和体内疾病模式相结合，将提供大量基因功能方面的有用信息，在药物开发过程的多个阶段促进靶点的筛选。 二．内源RNAi机制及功能研究 是什么原因使我们有可能通过外源siRNA诱导内源性的靶基因转录后沉默？为解开这个迷是题，更有效地进行RNAi应用，随着RNAi应用研究的广泛开展，生物体内部RNAi机制研究也愈加深入，并迅速成为RNAi研究中的重要领域，吸引越来越多的研究者投身其中，涌现出一系列令人耳目一新的新的成果。 多年来，生物学家认为RNA在生命过程中的作用仅仅是从DNA传递遗传信息到蛋白，就象蜂群中的雄蜂般没有创意。但近几年的一系列发现使研究者对RNA，尤其是mRNA以外的哪些小RNA的功能有了全新的认识。生物体中有一群小RNA（目前看来人体中编码约255种小RNA，竟占整个基因组近1%，很多可能编码自以前被认为“垃圾RNA”的区域），它们也可通过自身的RNAi机制，在生命过程的各个阶段关闭或调控基因表达水平，从而控制细胞的多种生命活动。尤其在过程中2003年有一些激动人心的最新发现：仅约22个核苷酸长度的小 RNA，发现竟能引导早期发育――从使植物叶片成形到介导果蝇胚胎在植物组织中的细胞增殖：缺少RNAi蛋白Dicer（一种RNA酶III家族的酶，参与RNAi过程中对RNA的剪切）的小鼠会缺少干细胞某些分化(swaths of stem cells)在出生前就夭折；小鼠中特定的小RNA能帮助引导干细胞生成胚胎的血细胞系统。 此外，有些RNAi现象能在DNA编码不变的情况下传代，甚至在一些物种中对基因组织进行调整，有人形象地比喻它为“引导基因组的手”，生动体现了小RNA源于基因组但对基因组所具有的强大反馈作用。《Science》上一篇题为：RNAi Extends Its Reach的综述详细阐述了RNAi途径已经不仅仅限于沉默mRNA，还作用于基因组。这方面的具体机制还不是非常明确，但在植物中发现伴随有DNA甲基化现象，科学家们预测要描绘一张完整的RNA引导基因组改变的图谱可能需要对RNA信号，DNA甲基化和组蛋白修饰之间的相互作用进行更进一步的研究。 综合来看，我们可将目前报道的内部RNAi机制可能的功能，大致分为以下几类： 1. 搞病毒功能 Voinnet和Li等分别在植物和果蝇中发现了通过RNAi实现的抗外源核酸机制：被大多数RNA病毒启动的RNAi可导致病毒基因组降解。例如在果蝇细胞中，Flock house virus(FHV)就能引发果蝇内部的RNAi反应，产生FHV特异性的siRNA来降解感染的FHV。 2. 基因调控 目前在人、蠕虫，果蝇和植物等生物体中都发现了小RNA，有的通过结合3’ 非翻译区（UTR）和靶mRNA抑制mRNA翻译，有的siRNAi机制破坏靶基因转录本。对基因表达水平进行调控。 3. 染色质浓缩 内源的siRNA，一些小RNA可能通过使染色质浓缩调节基因表达。一些研 究小组发现dsRNA结合到植物启动子区域能通过一种使DNA甲基化的作用导致基因沉默。此外，在蠕虫体内检测到许多Polycomb蛋白（能结合染色质）是RNAi过程所必须的：裂殖酵母中内源siRNA可介导中心泣区染色质浓缩，导致这个位点的基因转录沉默。如Vera Schramke等在裂殖酵母中通过合成shRNA反式抑制同源位点，导致在mate区沉默的Swi6染色质浓缩。这些结果都提示一些内源性的siRNA通过导致染色质浓缩来调节基因水平。 4. 转座子沉默 目前，两方面的证据提示转座子沉默涉及siRNA。其一，发现蠕虫mut-7基 因参与RNAi和转位抑制。其二，从裂殖酵母的忠心粒区分离出siRNA，并检测到这些siRNA介导此区内组蛋白甲基化。由于中心粒区包含重复序列――含转座子片段，一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子LTR（长末端重复序列）介导的RNAi，推测在siRNA介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用。 5.　基因组重组 siRNA可能参与纤毛虫，四膜虫结合中的基因重组。结合到重组序列的 siRNA，在虫体之间的结合过程中介导DNA缺失和染色体断裂。有趣的是，在这些siRNA介导的程序性DNA删除事件中，也发现需要重组区域组蛋白的甲基化。 结语：RNAi的确有太多的值得研究的领域和值得期待的发现，我们真诚地 希望科学界能在探索小RNA世界的潮流中占据令人瞩目的一席。