非哺乳动物细胞体系的RNAi实验和选择

比如果蝇，线虫，拟南芥等低等生物和植物，由于不涉及抗病毒免疫应答反应，通过体外转录即可制备目标基因的dsRNA(通常200bp或以上)，直接用长双链RNA进行RNAi实验，不需要另外设计siRNA，因而比较简单。长双链RNA的制备很容易，省掉了设计合成单个siRNA的麻烦，并且长双链RNA在生物体内会被Dicer酶降解为多个siRNAs混合物，因而往往比单个siRNA更有效。长链dsRNA的递送方法依细胞种类而异，果蝇培养细胞转染、饲喂或者浸泡线虫、乃至显微注射等方法均可将dsRNA递送到目标细胞。dsRNA得到的是瞬时基因沉默。 体外转录： 常规的体外转录试剂盒通常是为体外转录合成单链mRNA而设计的，你可以分别合成2条单链RNA，再合并退火。不过你也可以将两个带相同启动子的模板合并一起做体外转录，最后再退火而得到dsRNA，还可以节省试剂。另外如果PCR时在模板两头带上同样的RNA聚合酶启动子，就可以用同一个模板在体外转录过程中同时合成双链dsRNA，省却退火一步，结果只是dsRNA两端多了启动子的序列。我们也可以将片段克隆到带2个反向相同RNA聚合酶启动子之间的载体上达到同样的目的。体外转录试剂选择的要点就是产量，速度；由于要避免dsRNA部分序列和其他基因重叠，避免非目标基因的沉默或者脱靶，通常不会选择太长的片断作为dsRNA的模板，因此对试剂盒合成dsRNA的长度，倒是不一定要求太高。

1. 号称RNA公司的Ambion是最早推广RNAi试剂的厂家之一，去年初被生命科学领域的巨头ABI以2.73亿美金高价收购其RNA部门而震动业界，2006和2007年连续成为美国The Scientist杂志最受欢迎的RNAi产品品牌大奖，可见其产品声誉和影响力之大。Ambion特别为非哺乳动物细胞体系的RNAi实验推出了MEGAscript RNAi Kit（20rxns），以目标基因两端带T7聚合酶的PCR产物或者质粒为DNA模板，提供除模板外，体外转录反应涉及的各种试剂，每次反应可得到高达80ug的纯化的dsRNAs，最长可达1.2kb。体外转录得到dsRNA后，利用试剂盒提供的DNase和单链特异的RNase降解反应产物中的DNA模板和单链未配对的RNA，最后用试剂盒提供的纯化柱去除蛋白质，核苷酸等杂质后得到纯化的、立即可用于RNAi实验的dsRNA。这个试剂盒的特点是Ambion专利的MEGA体外转录技术，使得产量高于普通体外转录试剂盒，试剂盒包含了体外转录合成dsRNA和后继纯化所需试剂，包扩DNase（消化DNA模板），单链特异的RNase（用于消化未匹配为双链的单链RNA），和RNA纯化柱等成分，对以异常敏感的RNA实验来说可以省却不少麻烦。4600RMB/20次反应(每次反应成本230多，不计折扣)，——用这种方便齐全又好用的试剂盒做实验，实验过程也是快乐流畅滴。至于付款时的烦恼，留给亲爱的老板吧。

2. 纽英伦（New England Biolabs）的HiScribe RNAi试剂盒也是一个合成双链RNA的试剂盒。这个盒子的特点在于提供了LITMUS克隆载体，这个载体多克隆位点的两端有反向T7启动子序列，将目标基因克隆到载体中后，即可以用试剂盒提供的T7引物PCR得到两端带T7序列的模板，也可以分别用T7启动子后的2个酶切位点分别单酶切线性化质粒，使酶失活后再混合，得到2种不同的模板，再同时进行体外转录，退火，得到除多克隆位点外不含其他冗余序列的RNA，避免T7聚合酶在合成目标基因RNA时通读载体上的序列，影响RNAi结果。除体外转录试剂外试剂盒提供载体和对照载体，T7引物，分子量Marker等，还需要自行购买DNase，单链特异RNase（核糖核酸酶I）以及dsRNA纯化工具。试剂盒2007年价格在3969元人民币，可合成总量高达2mg的dsRNAs，长度可达1.3kb。

3. Promega公司的T7 RiboMAX Express RNAi System也是一个体外合成dsRNA的试剂盒。特点是合成速度很快，30分钟完成体外转录，适合合成200-400bp或者更长的dsRNA，还可以用于合成21bp的siRNA。产品提供T7 RNA聚合酶，Buffer(含NTP)，消化DNA模板用的DNase和消化单链RNA用的RNase，对照模板，最后需要用异丙醇沉淀来纯化得到的dsRNA。整个试剂盒足够合成最高可达2mg的dsRNA，由于没有配纯化的离心柱，可根据需求决定每次使用试剂的量。不带Marker和引物等对照，价格3195，真不愧是美国“大宝”，价格便宜量又足啊。

4. 如果不怕麻烦，小米加步枪也可以的。通过PCR的方法，或者克隆的方法得到两端带有T7启动子的基因片段模板，自行组装试剂组合----T7 RNA聚合酶，单链RNase，DNase，NTP等等，也不难，要注意防止RNase污染。纽英伦（New England Biolabs）T7 RNA聚合酶参考价格为5000U（50U/ul)才人民币696元。