改善RNA提取的4点建议
在分离RNA时，良好的实验室技术很关键。与DNA相比，RNA更加娇贵，也更不稳定。RNA含有高反应性的羟基（C-OH）基团，确保链不断合成、分解和再次利用。分离
| 在分离RNA时，良好的实验室技术很关键。与DNA相比，RNA更加娇贵，也更不稳定。RNA含有高反应性的羟基（C-OH）基团，确保链不断合成、分解和再次利用。分离出的RNA迅速降解，并很容易受到核糖核酸酶（RNase）的污染。RNase似乎随处可见。 加利福尼亚州科学院（California Academy of Sciences）的Jack Dumbacher博士目前正开展转录组和小RNA的分离，以便鉴定宏基因组病毒序列。他的研究目标是了解病毒与宿主的共生关系。Dumbacher博士为改善RNA提取提出了几点建议。 优化RNA的保存 研究小组常常从偏远地区采集样本，如热带雨林或珊瑚礁。他们的最大挑战在于无法用液氮迅速冷冻样本，而RNA在乙醇中逐步降解。于是，他们用拭子蘸取鸟的泄殖腔，并放在RNA稳定剂或其他包含4M 硫氰酸胍（GITC）的溶液中。由于盐的浓度，一些RNA稳定剂可能会给RNA的分离造成困难。当然，如果能解决冷藏问题，保存RNA的最好办法是采集后立即用液氮冷冻样本，并保存在-80°C。 确保良好的分离 GITC溶液通常用于RNA提取中细胞和病毒颗粒的裂解，同时防止RNase的酶活。在这种情况下，研究小组必须在裂解之前进行完整病毒的分离，以便与细胞分开。在现场，他们用0.2 µm的过滤器来过滤较小的病毒颗粒。而较大的颗粒（如完整细胞）则被留下。其他实验室若使用冷冻的组织样本，则必须快速彻底地匀浆。无论选择哪种方法，始终会有些基因组（gDNA）存在。具体有多少则在很大程度上取决于用户的经验和技术。 尽量避免RNase 在实验室中，避免已纯化的RNA接触到内源和外源的RNase至关重要。在纯化开始时，外源RNase不怎么成为威胁。但在没有了变性剂（如GITC）的保护以及RNA纯化完成后，你就要避免接触RNase。RNase抑制剂隔离残留的RNase，适合大部分应用，特别是那些包含内源RNase的应用。科学院的比较基因组实验室使用经DEPC处理的水。DEPC通过碱基的组氨酸修饰而让RNase失活。同时记住，及时更换手套。 提高RNA的产量 不同组织不同样本的RNA产量会相差很大。对于Dumbacher博士而言，每个样本的RNA量都很低。他们所获得的RNA量取决于小鸟最后一次进食的时间，吃了什么。Dumbacher小组的下游应用是新一代测序。他认为，即使样品的RNA含量很低，但在构建文库以及获得最终结果时还是会觉得不错。 若要提高组织样本的RNA产量，避免过度匀浆或加热。匀浆30秒，再休息30秒，可改善RNA的回收。同时，用更多的水洗脱可释放更多RNA。无论您的实验室采用何种下游技术，成功的分析都取决于良好的RNA分离技术。孰能生巧，多试试一定行。 (责任编辑：大汉昆仑王) |
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