RNAi基础知识介绍

最近由于RNA 干扰（RNA interference，RNA i）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象最早是在秀丽线虫中发现的（1），是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。由于最近两年在RNA i领域取得的进步，已经有许多这方面的综述发表（2-4）。RNA 干扰是由长的双链RNA 分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA 。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA 的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA 分子（small interferingRNA s，siRNA s）掺入RNA 诱导的沉默复合物（RNA -induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA 。

这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA 分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA 可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破（5）。这个发现激发了大量利用RNA i技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNA i的性能明显较高。

有趣的是，除了短双链RNA ，短发夹RNA （short hairpinRNA ，shRNA ），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA ，从而产生RNA 干扰（6、7）。这使得构建表达干扰RNA 的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能（4、8）。shRNA 可以利用RNA 聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA （small nuclearRNA ，snRNA ）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的组分H1RNA （11）转录的。另外一种办法是两段短RNA 分子分别用U6启动子转录出来（6、12、13）。载体介导的siRNA 表达使对功能缺失（loss-of-）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象（11）。

另外一种延长siRNA 抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA 进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA 在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA 的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷（14）。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA 、3'端为4个甲基化核苷的siRNA 与序列相同但是未经修饰的siRNA 比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA 中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA 活性下降。

RNA 干扰在哺乳动物体内的第一个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA 的质粒注入老鼠的尾静脉（15、16）。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA 干扰实验（17）。注射siRNA 之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA 和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA 处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。

上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA 干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA ，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因（18）。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA 的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA 的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制（19）。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和最小的polyA尾的RNA 聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA 载体打开了大门。

总的来说，siRNA 的第一个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA 引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA 干扰引起的严重副作用。因为用siRNA 使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。

总结

经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA 是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA （这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA 分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。

RNA 干扰

RNA 干扰（RNA interference,RNA i）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-strandedRNA ，dsRNA ）诱发的、同源mRNA 高效特异性降解的现象。近几年来RNA i研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNA i技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。