RNA实验

RNA 在脊椎动物的胚胎和器官中的整体标本原位杂交和检测实验（小鼠或者鸡的胚胎以及器官中的整体原位杂交）

2024-06-14 RNA实验加入收藏

材料与仪器小鼠或鸡的胚胎或器官PBS 冰预冷 PBT： PBS 中加 0.1% (V V) Tween 20 4℃及室温 4% （m V)高聚甲醛溶于 PBS

材料与仪器

小鼠或鸡的胚胎或器官
PBS 冰预冷 PBT： PBS 中加 0.1% (V V) Tween 20 4℃及室温 4% （m V)高聚甲醛溶于 PBS (4% PFA) 4℃ PBT中溶25%、50%、75%的甲醇（甲醇 PBT) 100%甲醇 PBT中溶6% (V V)过氧化氢（H2O2; Aldrich)(可选）
解剖工具（如剪刀和镊子） 70%乙醇浸泡解剖显微镜 20 ml咬合盖（snap-cap)玻璃小瓶小勺或者刮铲用来放置2 ml小离心管的带有适配器的加热板旋转平台（Rocker platform)

步骤

1) 如果有必要的话，在冰冷的PBS溶液中，使用合适的解剖器具在解剖镜下将小鼠或鸡的胚胎切成小块。完全除去胚胎外膜和胞衣。打开腔。

2) 将样本转移到装有10 ml左右冷的4%多聚甲醛的20 ml咬合盖玻璃小瓶中。4℃固定4 h到过夜。

3) 4℃下用PBT洗样本两次。即使样本不做存储立即使用，也建议进行脱水、水化和漂白步骤（步骤4〜8)，这些步骤可以改进组织的浸透性并且增加方法的灵敏度。也可以选择胚胎直接从步骤8开始操作。

4) 室温下分别用25%、50%和75%的甲醇/PBT洗样本，最后用100%甲醇再洗2次以达到脱水的目的。

5) 室温下使用甲醇/PBT溶液以相反的步骤洗样本，最后再用PBT洗2次以水化样本。

6) 可选步骤：用含有6%双氧水的PBT溶液室温下漂白样本15 min。

7) PBT溶液洗样本3次。

8) 用溶于PBT中10μg/ml的蛋白酶K室温下消化样本15 min。

9) 用新鲜配置溶于PBT中的2 mg/ml甘氨酸洗样本以终止消化。

10) PBT洗样本2次。

11) 新鲜配制的0.2%戊二醛/4%多聚甲醛/PBT再在室温下固定样本20 min。