293T细胞的培养

　包装细胞293T细胞的培养

　　一、293T细胞的冻存

　　1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

　　2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

　　3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

　　4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

　　5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

　　6. 细胞计数。

　　7. 将细胞离心，1000rpm，2min。

　　8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+ 20% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

　　9. 分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。

　　10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

　　11. 复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。

　　二. 293T细胞的传代

　　1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

　　2. 消化细胞，方法同上。

　　3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。

　　4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

　　5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

　　三. 293T细胞的复苏

　　1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

　　2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

　　3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

　　4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

　　5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

　　6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

　　用于包装的293T细胞的培养

　　用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。任何时候细胞汇合率都不准达到100%。

　　慢病毒的包装

　　1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素。

　　2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个。

　　3. 第二天，镜下检查细胞。细胞融合度应大致为30-40%，分布均匀。

　　4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

　　5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包装质粒和84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml。另一支中加入500 µl Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀。将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。

　　关键步骤：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。

　　6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分结合形成转染复合体。

　　7. 取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体均匀滴加入到细胞培养板中，每板3ml。来回晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱。每一皿细胞培养盘不要超过6盘。

　　8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基。

　　9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近60-80%。如果所转染质粒带有GFP荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。

　　10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）。在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。

　　11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中。

　　12 .4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。

　　13.总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤。如果发现滤膜被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。