RNA Markers的使用方法(适用于RNA Marker RL1,000、RL6,000、RL10,000

RNA Marker ( RL1,000; RL6,000; RL10,000)

可以进行一般琼脂糖凝胶电泳和变性琼脂糖凝胶电泳。

以RL10,000为例，具体使用方法如下：

普通琼脂糖凝胶电泳时 1.按下列组份配置RNA Marker样品。

2.均匀混合后65℃加热10分钟，迅速冷却至室温（最好用PCR仪)。

3.使用高质量的琼脂糖，用1×TAE Buffer制备3%凝胶*，制胶时凝胶中请加入溴乙锭(最终浓度：1 μg/ml)。

4.将上述操作2配制的Marker样品加样后，在1×TAE Buffer中电泳。

* RL6,000; RL10,000使用3%凝胶，RL1,000需使用5%凝胶。

甲醛变性琼脂糖凝胶电泳时

1.按下列方法配制5×MOPS-EDTA Buffer（0.1 M MOPS pH7.0，5 mM

EDTA, 10 mM CH3COONa)。

①称量20.9 g MOPS置于1 L烧杯中。

②加入约700 ml的DEPC处理水，搅拌溶解。

③使用2 N NaOH调节pH值至7.0。

④向上述溶液中加入10 ml的1 M CH3COONa（DEPC处理水配制)。

⑤溶液中加入10 ml的0.5 M EDTA pH8.0（DEPC处理水配制)。

⑥DEPC处理水将上述溶液定容至1 L。

⑦使用0.45 μm滤膜过滤后室温避光保存。

2.按下列组份配制RNA Marker样品。

3.均匀混合后，70℃加热5分钟，迅速冷却至室温（最好用PCR仪)。

4.甲醛变性琼脂糖凝胶配制如下*：制胶时加3 g高质量的琼脂糖到93 mlDEPC水中，另加30 ml 5×MOPS-EDTA。煮沸直至完全溶解。加入DEPC水定容至123 ml。让溶液冷却至60℃左右后，加入27 ml 37%甲醛（在通风橱中操作）倒胶后于室温静置1小时。

5.加样前将胶在1×MOPS-EDTA中预电泳30分钟。

6.混匀电泳槽中的1×MOPS-EDTA Buffer（电泳液)，加入上述操作2配制的RNA Marker 样品后，10 V/cm（恒压）条件下电泳1小时左右，此时应每隔30分钟混匀电泳槽中的电泳液一次。

7.电泳结束后，将凝胶在DEPC处理水中浸泡15分钟，除去凝胶中的甲醛。

8.使用DEPC处理水制备的EtBr（5 μg/ml）染色2 ～ 3分钟。用DEPC处理水脱色30分钟，再换水脱色30分钟后成像观察。如果背景偏高时可以进一步将凝胶脱色。 * RL6,000; RL10,000使用3 g琼脂糖胶粉，RL1,000使用6 g琼脂糖胶粉。

注意：甲醛凝胶用EtBr染色较为困难，即使RNA样品染上了明显的条带也会带来较高的背景。因此，应控制凝胶在染色剂中的浸泡时间小于5分钟，以降低背景。 Note使用注意

1.RNA极易分解，应严格防止核酸分解酶的混入。实验操作时应带手套，实验的仪器及溶液应经DEPC处理。操作不严禁会造成RNA降解，导致RNA Marker中的条带不清晰或不完整。

2.RNA Marker中的RNA为单链线性RNA，因此，当进行体外转录得到的RNA、或经提取得到的mRNA等单链线性RNA电泳时，可使用本制品作为分子量大小的参照标准,但对于Total RNA, 本Marker只能作为定性参照标准。

3.若脱色后观察不到Marker的条带，可能是由于胶被染上了较高的背景，此时可以进行反复脱色后再进行观察。