PCR操作规程及污染的监测与防治

PCR与定量PCR反应最大的魅力是扩增能力与高灵敏度，但易污染一直是困扰各实验室的大问题，极微量的污染就可能造成假阳性反应，破坏实验结果。如何监测与防止PCR污染，是现在各实验室的重要课题。一、污染监测一个好的PCR实验室，必须要时刻注意污染的监测，考虑是否受到污染，如有污染，是何原因造成的。通过有效地监测，采取正确的相应措施，防止或消除污染。对照实验是监测PCR污染的重要手段。1.  阴性对照：阴性对照是每次PCR实验都必须做的。它包括了标本对照与试剂对照，通过对照确认样本和试剂是否受到感染。2.  阳性对照：它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 阳性对照要选择扩增度中等、重复性好、经鉴定是该产物的标本。但阳性对照其对检测或扩增样品污染 的可能性很大。因而当某一PCR试剂已经使用稳定，检验人员完全掌握时，在之后的实验中应尽可能免设阳性对照。来减小污染概率。3.  选择不同区域的引物进行PCR扩增。4.  重复性试验。二、防止污染的方法1.  合理分隔实验室：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增以及PCR产物的鉴定等步骤进行分区或者分室，尤其要将样本处理和PCR产物的鉴定与其它步骤严格分开。理想的分区为，标本处理区、PCR 反应液制备区、PCR循环扩增区、PCR产物鉴定区。

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2.  PCR试剂要做好预混和分装：所有的PCR试剂都应进行小量分装，PCR反应液应尽可能预先配制好，然后再小量分装，在-20℃下保存，以减少重复加样次数，从而避免污染机会。另外，PCR试剂、PCR反应液应当与样品及PCR产物分开保存，不可放于同一冰盒或冰箱。3.  吸样枪污染防护：吸样枪是一个非常容易发生污染的设备。如操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘在枪头上，将会成为一个严重的污染源，因而使用吸样枪时要格外小心，吸样要慢，并尽量一次性完成，忌多次抽吸，避免发生交叉污染或气溶胶污染。4.  减少PCR循环次数：以PCR产物达到检测水平为宜。5.  防止操作人员污染：使用一次性手套、吸头、小离心管。