重组 PCR

重组 PCR 构建定点突变序列，是指 PCR 产生的同源 DNA 末端在大肠杆菌内通过体内重组使 DNA 连在一起。

重组 PCR 构建定点突变序列的基本原理是 PCR 产生的同源 DNA 末端在大肠杆菌内通过体内重 组使 DNA 连在一起。研究者已经证明，含有短同源末端的 DNA 片段可以在大肠杆菌胞内进行分子间重组，包括在常用于克隆的大肠杆菌 RecA-株中。与重叠延伸 PCR 相同的是，重组 PCR 也要包括两个分别进行的 PCR 反应，产生两种产物，只是引物设计要使得一种 PCR 产物的每一末端都与另一 PCR 产物的不同末端同源。将这两种 PCR 产物混合转化大肠杆菌，两种产物的同源末端在体内重组，形成环化重组体使转化完成。如果重组体环状分子含有复制序列和选择性标志，如抗 生素抗性基因，那么这种重组体可在转化的大肠杆菌菌株中增殖，并使重组菌落得到筛选。利用重组 PCR 可以构建点突变体，也可以重组 DNA 片段。在构建点突变体时，先用内切酶将欲施以突变的质粒在每一对引物的扩增靶区域之外线性化，分别作为模板进行 PCR, 引入突变并 扩增靶序列。由于扩增反应中的突变碱基是相同的，因此每一产物的突变末端相互同源。非突 变引物的扩增片段末端也是同源的，将两种未经纯化的 PCR 产物混合，转化大肠杆菌后会得到含有所需突变的重组子。图解示意如下。

器材：

PCR 扩增仪、电泳仪、水平电泳槽

试剂：

①两种限制性内切酶及其缓冲液。

②10 X PCR 缓 冲液：内含 15 mmol/L MgCl2 , 500 mmol/L KC1, 100 mmol/L Tris-HCl（pH8. 3, 25°C）。

③10XdNTP 混合物：内含 2 mmol/L dGTP, 2 mmol/L dATP, 2 mmol/L dCTP 和 2 mmol/L dTTPo

④4 种寡核苷酸引物

⑤模板 DNA

⑥热稳定 DNA 聚合酶。

⑦凝胶：含 0.5 g/mL 溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶。

⑧大肠杆菌感受态。