RNA标本PCR反应模板的制备

一、血液单核细胞RNA制备

1. 用密度梯度法制备血中单核细胞；

2. 取出单核细胞用PBS洗2次，每次300g离心5min；

3. 洗后的单核细胞沉淀用200～400μl含0.5% NP-40的预冷的IHB（0.01% DEPC配制）重新悬起；

4. 离心10sec沉淀细胞核，若有必要，可收集细胞核DNA，但应洗去DEPC；

5. 将上清转至另一离心管中，置37℃保温20min，然后在90℃水浴10min，水浴过程中要保持离心管盖松弛，使降解的DEPC逸出；

6. 高速离心，取5～10μl上清用于RT-PCR。

注意事项

1. 由于DEPC可破坏DNA和RNA，因此，90℃水浴这一步是除去DEPC的关键。

2. 此方法也可用于组织细胞 RNA的提取。

二、哺乳动物组织和细胞RNA制备（SDS-酚-氯仿法）

1. 确定要处理的组织样品的质量；

2. 按每100mg组织0.5ml SDS和1ml的酚或每1×106个培养细胞0.2ml SDS和 0.4ml的酚的比例加入试管中；

3. 将组织样品置于试管中匀浆至少30s；

4. 加入1/10体积的4℃乙酸钠，混匀；

5. 4℃，12，000g离心10min；

6. 小心移出上层（含有RNA）转移至另一试管，加入5份酚和1份氯仿/异戊醇（24：1）的混合物，摇动15sec后重复离心步骤；

7. 水相移至另一离心管中加入1/25体积的冷的5mol/L的NaCl和2倍体积的冷的无水乙醇，混匀置-20℃过夜；

8. 4℃，12，000g离心10min，小心倾去乙醇；

9. 用75%的乙醇清洗RNA，4℃，12，000g离心10min，小心倾去乙醇；

10 用20～50μl去离子水溶解RNA沉淀，-70℃保存。