PCR反应中Taq酶的选择

随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一目了然了。高特异性Taq酶高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素很多，包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性Taq 酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程，也为PCR产物快速有效的纯化（PCR产物直接纯化）打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。大家都知道，在PCR第一个循环变性之前，有一个升温的过程，引物和模板会有一些非特异性配对，如果这时Taq酶发挥活性，就很容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经过后面的指数扩增，就会严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。

而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶，因此在初始循环的变性之前它没有活性，不会产生非特异性扩增，这就大大提高了PCR扩增的特异性。第一代热启动Taq酶往往直接在Taq 酶上做一些修饰，比如用抗体抑制，蜡封等，如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品，由于抗体、蜡等异物的掺入，对实验造成一定的影响，也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，真正实现便利的热启动，代表产品如QIAGEN公司的 HotStar系列，无需别的辅助抑制物，也不用担心抑制不稳定，使用起来方便、高效。此外，由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用，一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl，QIAGEN公司的缓冲体系通过 KCl、（NH4）SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。此外，热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒，在RT反应较低温度下，Taq酶没有活性，逆转录酶发挥活性；RT反应结束，高温灭活逆转录酶的同时，激活Taq酶，进行PCR反应。另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTM Tth DNA聚合酶，本身就具有逆转录酶活性，也可用作RT-PCR。高保真Taq酶下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对PCR保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真Taq酶具有3‘到5’核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往扩增效率低一些，有的还容易降解引物，且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。

目前市面上主要有两类产品，一类是混合型的高保真酶，将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶（用于提高扩增效率）混合起来，错配率在8-9 X10-6碱基/循环数。Clontech、LTI等公司都有此类产品。如果要求更高的保真度，就要选择单一型的高保真酶，如Stratagene的 Pfu，NEB公司的Vent DNA 聚合酶，错配率5.7 X10-5碱基/循环数；QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体，其聚合酶及Proofreading活性都为热启动，可避免引物降解，错配率达2-4×10-6碱基/循环数，加上优化的反应体系，可在室温下配置反应液，可进行复杂模板（高GC含量、二级结构）及长片段的扩增，的确是这类酶中的佼佼者。高耐热性Taq酶对于有些模板变性温度较高，需要时间较长的用户，可能要求高耐热性Taq酶，这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，两者都是从海底火山口分离出来后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95℃半衰期近7小时，100℃近2小时；后者更甚，分别为23小时和8小时。超长片段扩增Taq酶对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户，可能会用到超长片段的扩增，Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达40kb。关于复杂模板的扩增对于模板结构复杂，如GC含量高（>60%），有二级结构等，普通的Taq酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但 DMSO有毒，而且用量需要优化。QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。关于条件的优化现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液，如QIAGEN公司的缓冲体系，对温度和Mg2+的耐受性很强，随试剂盒有推荐的操作手册，大大减少了反应条件的优化，如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物，一次成功率极高。但任何东西都不是万能的，如果碰到比较特殊的情况，还需要仔细分析，优化调整。以上就Taq酶的一些基本分类分别进行了介绍，具体选购时要根据实验需要择其重点，再参照其他参数，才能选到最合适的Taq酶。我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家，希望能帮助大家更快更好的达到实验目的。