PCR扩增方面的技术解答

1、PCR括增的基本原理

PCR (Polymerase Chain Reaction) 是体外高效复制DNA的技术，该技术几乎贯穿于现在分子生物学的各个领域。PCR体系由模板，特异性引物，高温聚合酶，脱氧核糖核酸几部分组成。反应过程分模板高温变性（Denaturation），引物与模板低温退火（Annealing）,引物在高温聚合酶的作用下延伸（Extention），在一定的条件下，退火和延伸可以合二为一。

2、高温聚合酶分类

高温DNA聚合酶主要用于DNA片段的高温快速扩增（合成），它以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和Mg离子存在时，在特定的引物引导下按5’-3’的方向合成DNA。目前，用于高温DNA合成聚合酶就其本身的特性分成三类：第一类酶具有5’-3’方向的DNA合成（聚合）性能，没有3’-5’方向的外切酶特性。

如Taq DNA聚合酶及其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA聚合酶强，因为它不能纠正合成过程中出现的突变。第二类和第一类酶类似，它有合成特性，没有3’-5’方向的外切酶活性，即不具备保真性能。不同的是它们能以RNA为模板，合成DNA。也就是说它们具有逆转录功能。如Tth DNA聚合酶。

第三类酶具有第一类酶的DNA聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们具有3’-5’方向的外切酶活性。如Pfu DNA聚合酶。正是酶本身具有的外切酶活性，Pfu能够纠正DNA扩增过程出现的错误，如点突变。不足之处是该类酶的DNA延伸能力不及其它两类。目前人们试图用各种手段来提高第三类酶的延伸性能，它在现代分子生物学实验中越来越收到重视。

3、如何选酶?

根据扩增产品的用途确定。第一类酶如Taq DNA聚合酶的主要用于检测基因或特定DNA片段是否存在，制备DNA探针，T/A克隆时在DNA片段末端添加单个碱基，和Pfu一道用于较长DNA片段的扩增。这类DNA扩增，DNA片段中可能存在的突变不影响实验结果。

第一类酶大多数使用场合，第二类酶都可以用。需要注意的是Tth的长链PCR扩增的能力不及Taq酶。人们更多注意的是Tth的逆转录功能，用它来实现基因单管单个酶的RT/PCR扩增检测。和传统的AMV和MMLV 逆转录酶相比，Tth的RT是在高温下进行的，能有效的解除RNA中的二级结构，是扩增出的基因更为完整。

不足之处：Tth的RT能力不及AMV和MMLV 逆转录酶。第三类酶以Pfu DNA聚合酶为代表。Pfu是已知DNA聚合酶中，保真性最高的聚合酶。它扩增出的DNA产物，随机突变少，保证性能为Taq DNA聚合酶的10倍以上。Pfu主要用于克隆表达基因片段的合成，用于DNA突变实验。

如果要求扩增DNA片段中的错误特别少，减少下游分子操作不必要的回复突变工作。高保真DNA扩增，使用Pfu DNA聚合酶是唯一的选择。需要指出的是：用Pfu的DNA扩增，突变少，但不是无突变无错误扩增。Pfu的不足之处是扩增能力较差，2kb以上的基因扩增需要优化反应条件。

将第一类或第二类与第三类酶按特定比例混合，能部分提高PCR扩增的长度和产物的保真性。我们提供的Taq Plus和SuperTaq属于这类产品。这类产品的保真性一般为Taq酶的2倍左右。S公司声称Taq Plus的保真性达到Pfu的水平是没有科学根据的,是极其不负责任的。

4、如何选择酶的供应商?

用可靠可信的酶。国外品牌公司的酶质量是有保证的。理论上生产Taq的工艺不复杂，但是从非专业性生产商出来的产品往往不做严格的产品控制，他们的价格虽然低，但是给您研究带来的潜在的威胁很大。很多公司没有生产能力，为追求最高利润，经常更换供应商。

产品的稳定性受到影响。一般情况下他们不做质量控制。您买酶前最好问问他的酶是谁生产的，如果您仅仅被告知是国产和进口的，而不能告知明确的生产商，最好不要购买。

5、遇到问题怎么办?

影响DNA扩增的因数很多，酶的质量是个重要因素。 本公司提供的各类酶质量都经过严格的质量控制。

使用本公司提供的各种DNA聚合酶一般可以排除产品本身的质量问题。影响DNA扩增效率的几个重要因数：模板性质和用量、Mg离子的浓度、退火温度等。实际上 PCR扩增没有什么特殊的规律，做多了，您就成为专家了。如果您还不能得到满意的答案，请直接向申能博彩咨询。

6、如果您不能扩增出产物，表明您使用的试剂或过程有问题吗？

不一定。有些扩增，您的引物，PCR扩增使用的酶，dNTP可能都没有问题，只是可能您没有使用最合适的条件。有些基因表达量就是低，常规的PCR可能就没有办法扩增出来。如果所有的基因都是那么容易扩增出来，那有那么多形式的PCR技术如槽式PCR,Hot Start PCR, LA PCR。如果有时引物设计不合理，靠扩增技术的改进也不一定能弥补。