实时荧光PCR检测技术

众所周知，PCR（聚合酶链反应）技术自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。相比于传统的临床诊断方法，核酸诊断是分子水平上的诊断技术，可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷，比如，核酸诊断能直接揭示病原体的存在，能客观反映病原体在人体内感染及活动情况，可以作为临床治疗中的一个有效监控手段，另外采用核酸诊断技术还可以检测到常规检测方法难以检测到的病原体，例如可以克服酶免检测技术中从感染到抗体产生的窗口期问题。因此，以PCR技术为代表的核酸诊断技术在临床诊断中得到日益广泛的应用。

传统的PCR检测模式

传统的PCR检测模式一般需要三个步骤：1.首先需要对待测标本进行处理：通过裂解、纯化，提取标本中的病原体核酸（DNA或RNA）作为PCR扩增的模板；2. 采用PCR或RT-PCR技术对提取到的病原体核酸进行扩增；3.检测PCR扩增产物，检测方法包括凝胶电泳和类似于酶免反应的PCR-ELISA等。

实时荧光PCR检测技术

近年来，PCR技术有了重大改进。将传统PCR检测模式中的PCR扩增和检测相结合（即在同一个密闭容器中将PCR扩增反应与荧光标记探针检测结合在一起）检测目的核酸的检验方法纷纷出台。这样的检测方法称为“实时”PCR，表示PCR扩增产物可被实时检测。准确地说，“实时”是指在每一个PCR循环后检测扩增产物，当PCR扩增反应结束后，我们可以得到每个样品的PCR扩增产物变化曲线。通过分析这些反应曲线，不但可以得到病原体的定性检测结果，还可以对病原体的数量进行精确定量。

实时荧光PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于应用了荧光探针，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。而实时荧光-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端从而可以快速以及动态地检测PCR扩增产物并减少外来核酸造成的污染。

实时荧光PCR技术基于荧光共振能量迁移（FRET，Fluorescent Resonance Energy Transfer）原理：当两个荧光基团靠近时，高能量荧光基团会将受激发产生的能量转移到相临的低能量荧光基团上。由于标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化可以反映PCR扩增产物的数量变化，从而使得荧光PCR技术可以起到实时检测的目的。目前，根据荧光基团在寡核苷酸探针上的不同标记形式，各种荧光PCR检测试剂盒所采用的荧光探针基本可以分为三种类型：Taqman探针、分子信标和荧光杂交探针

表1: Taqman探针、分子信标和荧光杂交探针的特点比较

采用实时荧光PCR技术需要具备集PCR扩增和荧光检测于一体的荧光PCR扩增仪, 目前临床中普遍使用的荧光PCR仪主要有ABI公司的5700型荧光PCR仪、Roche公司的LightCycler和BioRad公司的iCycler。三种仪器的特点比较见表2。

表2 ：三种荧光PCR仪的特点比较