单纯疱疹病毒感染的诊断方法

单纯疱疹病毒感染的诊断方法 　　单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科(herpes viridae).疱疹病毒科是一群中等大小的双链DNA病毒，有100个以上成员，根据理化性质分为α、β、γ三个疱疹病毒亚科.疱疹病毒感染的宿主范围极为广泛，可感染人类和其他脊椎动物，包括哺乳类、鱼类、两栖类、鸟类、有袋类等.疱疹病毒主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织.疱疹病毒感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感伏的趋向，严重威胁人类健康. 人疱疹病毒的分类 　　侵犯人类的疱疹病毒有7种，即单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1，HSV-2)、水痘一带状疱疹病毒(Varicella-zostervirus，VZV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、人疱疹病毒6型(humanherpesvirus，HHV-6)和人疱疹病毒7型(HHV-7). 单纯疱疹病毒分子生物学研究 　　在过去十年中，由于分子生物技术的引入，使单纯疱疹病毒的研究在分子水平上取得了突破性的进展，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)基因组的全序列已经弄清，对HSV基因编码蛋白作用与功能有了更多的了解.

(一)HSV基因结构研究进展 　　HSV基因组为一线性DNA分子，由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成，每一片段均含有单一序列和反转重复序列，长重复序列(RL)和短重复序列(Rs)中含有命名的为a的末端重复序列，由约400碱基对(bp)组成，在L和S片段之间，插有a的反转重序列，称为a'.由于L和S片段连接的方式不同，HSV的DNA共有4种同分异构体.HSV-117syn株的全部DNA序列已经弄清.该毒株DNA共含有152260个核苷酸残基，其中碱性核苷酸鸟苷酸和胞苷酸的含量(G+C)较高，达68.3%.HSV-1的基因组上，共排列有72个编码蛋白的基因，其中长单一序列(UL)上有56个，短单一序列(Us)上有12个，Us末端反转重复序列(TRL)，Us末端反转重复序列(TRs)，UL中间反转重复序列(IRL)和Us中间反转重复序列(IRs)上各一个，由于TRL和IRS上各有一个IE110基因，而TRs和IRs上各有一个IE175基因，所以HSV-1基因组上的72个基因共编码70个各异的蛋白质.在HSV-1的72个编码基因中，约半数的基因转录时阅读方向是从左至右的(右向)，但有37个基因的阅读方向是从右至左的(左向).在所有基因3'末端的上游，均有多聚腺苷化序列AATAA或ATTAA作为转录的起始.

(二)引物设计部位与序列及其意义 　　1.引物设计部位及意义 　　人类5种主要的疱疹病毒基因组的全序列测定即将完成，目前的研究资料显示HSV-1和HSV-2在核苷酸水平上有50%的同源性.HSV与EBV在DNA多聚酶，核糖核酸还原酶A、B单位以及糖蛋白B等方面有相当的同源性.HSV与CMV在DNA多聚酶等亦有相当的同源性.采用HSVDNA多聚酶基因作探针，在非严格条件下可以检出CMVDNA多聚酶基因，总之HSV-1、HSV-2、EBV和CMV4个疱疹病毒DNA多聚酶氨基酸序列，均有相当的同源性，基于这些理论，RozenbergF等人，根据疱疹病毒DNA聚合酶基因设计了一对寡核苷酸引物，用这对引物进行PCR，可以扩增出HSV-1，HSV-2EBV和CMV相应的DNA片段.如果配合对PCR产物进行限制性内切酶分析或特异性探针进行核酸杂交，便可将4个疱疹病毒分出.HSVDNA扩增区的选择主要集中在DNA聚合酶基因区，胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因区和糖蛋白基因区，检测HSV的PCR法有直接PCR法，巢式PCR法，免疫捕捉PCR法，和直接分型检测PCR法. 　　2.引物序列及PCR结果判断 　　引物1:CGACTTTGCCAGCCTGTACC，HSV-1518bp 　　引物2:AGTCCGTGTCCCCGTAGATG，HSV-2518bp 　　HSV-1/HSV-2型共同引物:ATGGTGAACATCGACATGTACGG，1561-1583469bp，(HSV-1) 　　HSV-1型特异引物：CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC，2337-2359，391bp，(HSV-2) 　　HSV-2型特异引物：CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC，1929-1951 　　探针：GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG，1675-1699 　　引物1：ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA 　　引物2：CATACCGGAACGCACCACAACAA 　　内引物 　　引物1：CCATACCGACCACACCGACGA 　　引物2：GGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA 　　探针：TACGAGGAGGAGGGGTATAACAAAGTCTGT 　　引物1：ACGACGACGTCCGACGGCGA 　　引物2：GTGCTGGTGCTGGACGACAC 　　探针：ATAGTGCCACGCCCACCACGTTCGA 单纯疱疹病毒感染的检测现状 　　为了从根本上控制HSV的流行，做好防治工作，加强实验室诊断方法的研究，为临床提供特异，敏感、早期、快速的诊断方法是非常必要的.

(一)病毒分离（细胞培养） 　　1.基本原理:细胞培养是以组织活细胞为母体，使活病毒得到扩增，引起宿主细胞病变(CPE).通过CPE出现的时间，特征等进行病毒检测. 　　2.方法评估:敏感的细胞系具有很高的标本检出率.经研究表明，在细胞培养中，只要有1-10个感染性HSV就可以检出，而ELISA和核酸杂交则需要104～106病毒颗粒，所以，细胞培养被广泛当作其它方法研究的参考--金标准.HSV可以在多种动物细胞中增殖，乳地鼠肾细胞(BHK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)、人胚肺细胞(HEL)、原代兔肾细胞(PRKL)、恒河猴胎肾细胞(FRHK)、人胎包皮细胞(HFF)、貂肺细胞(ML)、人肺癌细胞(A549、人包皮成纤维母细胞(MRC-5)、人新生儿肾细胞(HNK)等.在前面7种细胞中，以PRK出现CPE最早，其余依次是HFF、HEL、Vero.但各个实验室常以自已的条件，习惯来选择合适的细胞系.细胞分离HSV的临床标本检出率在15～99.5%.阳性高低不仅与细胞系敏感性有关，还与标本的来源部位，感染与恢复状况以及取材与送检过程、贮存都有很大关系.尽管HSV较易培养，但细胞培养费时、费事，使这一方法在临床检验工作中的普及应用受到限制. 　　3.研究与改进:(1)增强病毒的吸附.Winter和Lin用SVCC(Shell Viral Cell cultures)法，通过在特制的细胞培养瓶中种毒后，经700×g离心1h，然后培养可提高HSV检出率和缩短产生CPE时间.(1)与免疫学方法结合.利用活病毒在细胞内的扩增作用，再用免疫学技术进行快速诊断，如免疫荧光法(IFA)、免疫过氧化物酶法(IP)、生物素免疫荧光法(BA-IFA)等，缩短了细胞产生CPE结果鉴定标本的时间，并提高了特异性.(2)存在问题.需发现更好的细胞系，以便提高临床标本的总检出率;且实验室间方法及结果存在差异，需要进行方法学上的标准化;引进更灵敏的免疫学方法或其它技术，缩短时间、简化条件、提高特异性.

(二)抗原测定 　　HSVAg在临床标本的检测中，其方法学发展以快速、特异、敏感、稳定、方便及无损害性为原则，主要集中在ELISA、IFA、LA三方面研究与改进较多，而象RIA和免疫发光方法等应用较少. 　　1)，免疫酶方法(EIA) 　　1.基本原理:这是一种将抗体的特异性和酶的生物学放大作用有机结合在一起的特异而敏感的免疫学检测方法，酶可以直接标记在抗体或SPA上，也可以利用与抗酶抗体形成免疫复合物(Peroxidase-Anti-Peroxidase PAP).根据抗原抗体结合的严格特异性，用已知的抗体可以检测出未知的抗原.2.方法评估:由于免疫酶方法简便，不需要特殊仪器，所使用试剂对人体无害或危害较小，因而引近年来在HSV诊断上大受青睐.一般认为EIA的标本检出率在52.5～96.1%.3.研究与改进: 　　(1)抗原捕获.Cleveland(EIFT法，Enzyme Immuno filtration Technique和Zimmerman(MEIA法，Membrane Enzyme Immunoassay)分别用特制的滤膜来捕获临床标本中的感染细胞及游离HSVAg，快速并提高阳性检出率. 　　(2)特异性抗体.第四军医大学分子病毒室的双抗体夹心法由多克隆抗体改用单克隆抗体后，大大提高了特异性，同时采用多株单克隆抗体混合使用，还使EIA的敏感性提高，结果与国外报道一致. 　　(3)酶选择，目前主要用辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AKP).根据Clayton的试验结果，AKP较HRP敏感. 　　(4)底物选择.除常规用OPD外，Clayton改用TMB作底物(TMB-ELISA);Moss则用NADP作底物(AMP-ELISA)并与TMB-ELISA进行比较，发现敏感性NADP>TMB>OPD,另外还要根据实验要求而选用其它底物 　　(5)酶放大系统.用SPA标酶，由于SPA可以与不同动物的IgG结合，既可以快速、又增加了酶标物的广泛适用性;用抗过氧化物酶抗体与过氧化物酶形成免疫复合物(PAP法)，加入桥抗体连接检测系统，一方面克服了标记酶过程中对抗体和酶的生物学活性的影响作用，另一方面由于抗体的多级放大，较大地提高了敏感性，其敏感性甚至超过细胞培养;BAS(Biotin-Avidin System)是70年代用于免疫学检测的放大系统，由于亲和素与抗体偶联后，极大地提高了敏感性.Adler-Storthz用BA-ELISA(biotin-avidin-amplified enzyme-linked immunosorbent assay)检测灵敏度达90PFU(plaque forming unit)，但其稳定性较差;存在把亲和素(avidin)改用链亲和素(streptavidin)，用Biotin-Streptavidin构建的HERP CHEK ELISA检测HSV感染，使敏感性和特异性得到更大的提高，且稳定性好. 　　(6)存在问题.除了上述几个问题仍有待完善发展外，在快速和定量、检测自动化上仍有较多工作做. 　　2)免疫荧光法(IFA) 　　1.基本原理:在已知抗体上标记上荧光素，当抗原抗体特异性结合后，在荧光显微镜下，就可根据荧光来指示抗原抗体复合物的存在，从而检测病毒抗原. 　　2.方法评估:IFA操作简单，2～3h就可以出结果.特别是应用单克隆抗体后，特异性高，可用于临床诊断和病毒鉴定.但由于需要荧光显微镜，且结果带主观性，使普及应用受到一定限制.免疫荧光根据荧光素标记抗体情况可以分为直接法和间接法，直接法是荧光标记在第一抗体-即特异针对HSV抗体，直接法标记检出率10～82%;间接法是荧光素标记在第二抗体-即抗第一抗体的抗体，这种方法的优点除了增大了荧光抗体的应用谱外，还具有二级放大作用，从而提高了阳性率80～90%，但特异性下降. 　　3.研究与改进:(1)抗体选择.由于组织细胞中存在自然荧光，易出现非特异性结果.为了提高特异性，除了在方法学中作一些处理外，选用单克隆抗体无论是特异性上，还是分型上都较多克隆抗体好.(2)荧光素.利用不同荧光素发出不同荧光(phycoerythrin产生桔黄色荧光，FITC产生苹果绿色荧光)而分别标记在不同型特异性单克隆抗体上，可以在同一个标本中出现HSV-1和HSV-2的不同颜色荧光，从而直观地反应混合感染.(3)放大系统.可选用BA标记荧光素，BA-IFA可以提高敏感性.(4)存在问题.首先是IFA的敏感性有待提高，可以引进Biotin-Streptavidin系统;应解决目测定性的主观因素而向仪器自动化定量的客观指标方向发展;荧光显微镜的轻便小型化，以便适应基层单位和野外条件使用. 　　3)乳胶凝集试验(LA) 　　1.基本原理:将特异性的抗体与乳胶颗粒结合成复合物，当有HSVAg存在时，就会形成抗原-抗体-胶乳聚合物，出现肉眼可见的凝集. 　　2.方法评估:该方法的突出优点是快速，一般可在半小时出结果，不需要特殊仪器，适用于大批标本的筛检，但其敏感性差，约50%检出率，当与组织培养比较时，只有当CRE>10%，LA方能更好检出. 　　3.研究与改进:(1)增强凝集条件.试验过程中，加入一种样本吸收剂，并通过离心来增强乳胶凝集效果.(2)存在问题.主要是敏感性较差.同时应注重单克隆抗体在乳胶凝集中的应用.

(三)DNA探针杂交(DNA-PH) 　　1.基本原理:主要是利用四种脱氧核苷酸中硷基的配对性原则(G=C、A=T)建立的一种检测方法，选定病毒DNA某段序列合成或克隆互补性探针序列，标记上同位素或生物素，当样本中存在该段序列时，就会出现阳性结果. 　　2.方法评估:DNA探针作为一种HSV检测手段具有先进性和准确性，可检出1PgDNA、2～8个感染细胞或10个PFU.与细胞培养相比，其特异性为63～100%，敏感性为25.4～92%.但该方法要求试验条件高、费时费事，且标记同位素不仅有损害性，还不易保存，作常规检测受到限制. 　　3.研究与改进:(1)探针制备.一般探针长度在20～30个硷基，越长特异性越好.常用HSVDNA探针大多数从重组质粒如pRC101、pRC102、pBR222中用核酸内切酶切下已知DNA探针;也可以通过PCR方法扩增制备;目前最多是通过核酸自动合成仪进行合成. 　　(2)标记物.可以标记同位素3H或32P，H的半衰期长，因而结果重复性和标记探针贮存较好，但结果慢;P半衰期短，标记探针贮存较困难，但结果快，二者对人均有损害性，现在已有改用无放射性的生物素标记探针. 　　(3)分型.目前有分型和不分型二种探针，一般讲分型在病因学和流行病学上更有意义. 　　(4)存在问题.除了要进一步提高特异性和敏感性外，还要解决快速、早期诊断、降低试验成本和简化试验条件.

(四)抗体检测 　　所有用于检测抗原的免疫学方法经适当改良后，均可用于抗体的检测，如IFA、ELISA、RIA、LA......由于抗原方法的敏感性提高和PCR技术的应用，使得HSV抗体在HSV感染个体中的不均一性和不稳定性影响了这类指标在临床诊断中的意义，但作为一种感染有关指标，在一定的范围和情况下，仍有必要进行检测和深入研究.目前HSV特异性抗体的检测，主要有IgG、IgM和IgA三种. 　　1.IgG抗体:HSV-IgG主要用于HSE诊断中，单份血清中IgG抗体水平表示自然免疫状况，在我国HSV-IgG阳性率达90%以上，只有在特定部位如CSF中>1∶80、或神经鞘内HSV-IgG阳性才有提示感染的意义;双份血清中IgG抗体滴度有4倍以上升提高者、或血/CSF值在20～40∶1，才能诊断HSV近期感染;有些研究者对抗体HSV结构蛋白的特异性抗体进行了探计，结论不一，还有待进一步研究.IgG抗体在ELISA检测时可以跟IgM同步出现或稍后几天. 　　2.IgM抗体:HSV-IgM作为HSV感染指标，特别是脑部感染具有一定的临床积极意义.HSV-IgM出现在临床症状发作后第3天直到4周，初次感染者100%阳性、再次感染者48%阳性，虽然IgM抗体常作为许多传染病的早期诊断指标、但在HSV感染中，由于HSV反复感染均可引起IgM出现，影响了作为初次早期诊断的意义.HSV-IgM在CSF中的检测结果仍有争议，有的结果发现成人HSE的CSF中IgM滴度比血清中更高;有的则只有新生儿脑炎CSF中发现IgM抗体存在，成人脑炎CSF中未发现;但有的在HSE和急性硬化性全脑炎的CSF中未发现IgM抗体.一般认为IgM抗体不能通过血脑屏障，在CSF中检测HSV-IgM对HSE具有诊断价值. 　　3.IgA抗体:HSV-IgA是一种与局部免疫有关的抗体.SIgA可在HSK初次症状出现后第3～5天的泪液中达到高峰;在女性生殖道疱疹病毒感染的血清中，初次感染者以11SHSV-IgA为主，再次感染则以7S为主.单纯以ELISA检测血清中HSV-IgA出现，在初次感染者中阳性率为72.4%，再次感染阳性率为81%，所以从血清中检测HSV-IgA来确诊HSV初次感染是不可能的，但检测分泌物中SIgA作为局部感染的间接诊断指标和免疫指标仍有待进一步研究. 检测HSV PCR方法应用的评价 　　1.基本原理:选择病毒某段特定基因序列(一般多为保守序列)设计引物，由于引物与病毒该段基因存在着特异的互补性，当加入DNA聚合酶后，就会在引物的引导下合成该段段，序列片通过人为条件扩增放大后，就可以在电泳胶经溴乙淀染色，根据片段大小来判段标本中某种病毒的存在. 　　2.方法评估:PCR作为一种新型诊断方法，特别是它的灵敏度高，可检测到小致3个PFU，PCR的敏感性较细胞培养高，已初步在临床病毒检验工作中显示出了较大的优越性.但该方法由于高灵敏度，易产生污染而导致假阳性，且需要特殊的仪器和进口试剂，在普及推广中目前有困难. 　　3.研究与改进:(1)DNA诊断区的选择.目前均选择高保守序列区.主要集中在DNA聚合酶基因区、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因区、糖蛋白D基因区. 　　(2)引物设计.引物的大小在20～28个寡核苷酸，引物的数量有2个、3个、4个不等. 　　(3)与酶谱结合诊断.Rozenberg和Lebon选用HSVDNA聚合酶基因高保守区设计一对引物，可以扩增出HSV-1、HSV-2、CMV、EBV的DNA聚合酶基因片段，根据扩增产物片段的大小再结合SmaI和BamHI二种酶对不同扩增产物片段的酶切谱的不同进行分型、诊断. 　　(4)与Southen印迹法结合.Klapper等选用HSVTK基因保守区设计了一对引物，与生物素化的TK基因探针联合诊断、提高特异性. 　　(5)分型.在诊断HSV的基础上，不光试图对HSV-1、HSV-2、进行分型，并希望在一个方法中能把更多的相关病毒区分开如HSV-1、HSV-2、CMV、EBV. 　　(6)存在问题.对污染的DNA清除与破坏，克服PCR假阳性是一大难题;解决进口试剂等、降低试验成本将有利于PCR的普及. 应用PCR技术进一步研究HSV的课题及方向 　　PCR技术不但在HSV感染检测中具有重要的应用价值，而且在HSV分子生物学和HSV基因重组株构建及HSV的基因表达等课题研究中具有广泛的应用.

1.扩增未知的HSV基因 　　HSV-117syn+株的基因组的DNA序列已经测出，但HSV-1的其它毒株及HSV-2毒株基因组的大部分序列尚未作出，利用HSV-1之间及HSV-1和HSV-2之间在DNA序列上高度同源的原理，根据HSV-117syn+毒株DNA序列设计和合成引物，可扩增出HSV-1毒株和HSV-2毒株DNA中相应的片段，克隆和测序发现新的HSV基因.

2.HSV基因克隆和表达 　　HSV共编码70个各异的蛋白质，这些蛋白质有些可以诱生高保护作用的中和抗体，刺激细胞免疫，激活NK细胞活性，在免疫保护中起着重要作用，可作为亚单位疫苗应用，PCR扩增出HSV基因，再克隆入原核或真核表达载体中进行表达，作为基因工程疫苗或DNA疫苗.

3.构建重组HSV毒株. 　　HSVUL23基因为胸苷激酶(TK)基因，具有完整TK基因的HSV既可感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞.而TK基因部分或全部缺失的HSV只感染分裂细胞，尤其是神经系统的肿瘤细胞如神经胶质瘤细胞等，利用TK-的HSV在体内，体外杀伤神经胶质瘤的研究已进行了的深入探讨，并取得了令人瞩目的成就.用PCR扩增出HSVTK基因，再用内引物分段扩增TK基因，舍去其中的部分片段，将其余片段相连接后，克隆入转化质粒中，采用活细胞拯救技术，用转化质粒转化HSVDNA，筛选重组的TK-HSV进行研究.用同样的方法可以构建HSV其它基因缺失株或HSV-1/HSV-2重组株.

4.研究HSV基因结构与功能关系 　　PCR扩增和克隆HSV基因后，用点突变或饱和突变技术突变HSV基因DNA序列，构建突变株DNA或cDNA文库，筛选出功能与亲本株功能有异的突变株，以此研究基因结构与功能的关系. >

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