PCR技术

聚合酶链反应

2024-11-19 PCR技术加入收藏

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。开发史这项技术的发明人是

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

开发史

这项技术的发明人是Kary Mullis.１９８３年，在一家生物高技术公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。

原理和方法

众所周知，ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤Ａ对胸腺嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ）组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶－－ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）结合到ＤＮＡ模板上，最后，ＤＮＡ合成酶以这段引物为起点，合成与ＤＮＡ模板配对的新链。ＰＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。

假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是：

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.。.。.。.。.。.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.。.。.。.。.。.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

在ＰＣＲ之前，我们首先人工合成两段有２０－３０碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat.把这两段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合在一起，我们就可以开始做ＰＣＲ了。

第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分钟，让ＤＮＡ模板变性变成单链。

第二步叫“退火”，让样品的温度下降到５０－６５摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.。.。.。.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

ataagcccgaaaggttcgtt

tatccaacggctaggcattt

ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.。.。.。.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到数分钟，ＤＮＡ聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.。.。.。.。GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

ataagcccgaaaggttcgttGATC.。.。.。.。CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.。.。.。.。GATCtatccaacggctaggcattt

ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.。.。.。.。CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍，而这只需要两三个小时。