RFLP－－限制片段长度多态性

RFLP－－限制片段长度多态性

限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism） 　　RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis―Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是 RFLP 研究的主要目标之一。 1 原理 　　该技术是利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，对于不同种群的生物个体而言，他们的DNA序列存在差别。如果这种差别刚好发生在内切酶的酶切位点，并使内切酶识别序列变成了不能识别序列或是这种差别使本来不是内切酶识别位点的DNA序列变成了内切酶识别位点。这样就导致了用限制性内切酶酶切该DNA序列时，就会少一个或多一个酶切位点，结果产生少一个或多一个的酶切片段。这样就形成了用同一种限制性内切酶切割不同物种DNA序列时，产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段。后将这些片段电泳、转膜、变性，与标记过的探针进行杂交，洗膜，即可分析其多态性结果。 2 实验流程     限制酶酶切DNA片断→限制性酶切片段进行凝胶电泳→转膜→变性→与标记探针杂交        洗膜→结果分析 3 特点 　　优点：数据多态信息量大，呈共显性标记，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响。结果稳定，重复性好，探针多。 　　缺点：技术复杂，周期长，费用高；检测中需放射性物质，限制了广泛应用；检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低；DNA量大，分析速度慢。 4 应用 　　RFLP 技术多应用制作遗传连锁图谱，如水稻RFLP连锁图的建立。另外，根据 RFLP 制作的图谱可以进行对农作物及家畜遗传学的研究和开展人类相关遗传病的研究，以及品种的鉴定、分类等。

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