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微生物学

朊粒病的标本类型和处理

2024-04-18 微生物学 加入收藏
简介肮粒(Prion,PrPS )又名脉病毒、肮毒体, 是一类由宿主细胞基因编码, 构象异常的蛋白,其不含核酸, 抵抗力强, 具有自我复制能力和传染性, 可引起

简介

肮粒(Prion,PrPS )又名脉病毒、肮毒体, 是一类由宿主细胞基因编码, 构象异常的蛋白,其不含核酸, 抵抗力强, 具有自我复制能力和传染性, 可引起多种哺乳动物发生传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs), 如羊瘙痒病、克雅病、库鲁病、疯牛病等。目前在人类及20余种动物中发现有10多种自然发生或感染的玩粒病。

原理

传染性海绵状脑病(TSEs)即肮粒病, 是一种慢性退行性、致死性中枢神经系统疾病。不同来源的阮粒可呈现出明显的「毒株」差异, 如在潜伏期、临床特征, 神经病理表现以及玩粒的分子特征等方面有所不同。一般来说, 肮粒病共同特点包括:

① 潜伏期长, 可达数年或数十年;

② 发病后呈慢性、进行性发展, 死亡率100%;

③ 临床表现以痴呆, 震颤、共济失调等中枢神经系统症状为主;

④ 病理学特点表现为中枢神经系统神经元死亡, 弥漫性神经元缺失, 星状胶质细胞增生, 脑皮质疏松呈海绵状变性并有淀粉样斑块形成, 脑组织无炎症反应。

材料与仪器

(一)标本类型

冻存脑组织

步骤

朊粒病的标本类型和处理的步骤有以下几步:


实验前, 取出冻存脑组织, 室温解冻后, 在生物安全柜中, 用采样器在脑干一侧采集神经组织, 称重定量。因肮粒病病原及其引起的损害的重点部位在脑干的延髓(脑门), 故采样部位最好为延髓; 也可分别采集多部位(延髓、脑桥、中脑、丘脑、大脑皮质、小脑组织)同时检测。


采样完后另一半脑组织需完整保存于-80 ℃, 用于复检和确诊。在待测样本中加入 PBS 缓冲液, 通过匀浆, 超声处理, 使之成为10%(WIV)的脑组织悬液。将一定量上述脑组织悬液与等体积预冷裂解缓冲液混匀, 低速离心后, 取上清液(即「样品产」) 进行蛋白酶 K 处理(如37 ℃ 消化 1 小时), 以破坏对蛋白酶K敏感的 PrP。用苯甲基磺酰氟(PMSF)终止蛋白酶K反应后所获得的样品即为「样品一」。


此外, 还可采用甲酸、SDS 等处理标本提取物, 以促进 PrPS 分子表位的暴露, 再进行抗原抗体反应。

注意事项

① 所有样品的处理过程均需遵守相关生物安全规程, 如标本处理需要在 2 级或 3 级生物安全柜中进行; 操作中尽量避免气溶胶产生, 避免刺伤、划伤。

② 由于不同类型阮粒病的脑组织 PrP「含量不同, 对蛋白酶 K 的抵抗力也不相同。因此, 除了对蛋白酶 K 消化条件进行优化外, 还应在实验前对样本进行初步判断, 以确定蛋白酶 K 的用量。例如: 对于 sCJD 患者, 蛋白酶 K 工作浓度一般为 20 ug/ml, 时间为 1~2 小时, 而对于 FFI 患者, 蛋白酶 K 的工作浓度一般为 5 ug/ml, 且消化时间不超过 30 分钟。

③ 待测样本应与阳性对照(疯牛病牛脑组织)阴性对照(健康牛脑组织)同时处理。


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