病毒的分离和鉴定

虽然动物接种、鸡胚培养、器官培养（如气管软骨环）和细胞培养均可用于呼吸道感染病毒的分离和培养，但几乎所有病毒实验室采用细胞培养来培养呼吸道病毒，而鸡胚培养在疫苗生产中使用更多，实验室检测已很少用。

器材：
①一次性无菌手套
②培养箱
③离心机

试剂：
①材料：待采标本
②PBS缓冲液
③培养基

病毒分离和鉴定根据病毒种类不同，其基本步骤可分为如下几种：

（一）病毒的分离

1. 细胞系的选择 不同呼吸道病毒，应选择其敏感的细胞系／株进行培养。为了使所培养的细胞能适应多种病毒的分离培养，可通过建立混合培养细胞系，如结合水貂肺细胞（MV-1-Lu）和人腺癌细胞（A549）的R-mix细胞系可用于A型和B型流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒和腺病毒的分离培养。

2．特殊的培养条件

（1）流感病毒：该病毒穿入宿主细胞的前提是其血凝素被胰蛋白酶或者胰酶样酶切割，传代细胞MDCK不会产生这类酶，因此，为了帮助流感病毒进入MDCK细胞，需要在培养液中加低浓度胰蛋白酶。另外培养液中的小牛血清会灭活胰蛋白酶，因此细胞接种病毒标本前，应用无血清培养液或其他平衡盐溶液洗细胞。

（2）冠状病毒：不同冠状病毒，选择不同细胞系进行培养（表6-6）。值得注意的是培养冠状病毒的温度稍低，为33～35℃。

3．细胞病变特征

（1）流感病毒：引起MDCK细胞的病变特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落。
（2）副流感病毒：不同副流感病毒，其细胞病变的特征有差异，如感染hPIV-1的细胞变小而圆；感染hPIV-2的细胞，易出现细胞融合现象；感染hPIV-3的细胞，易出现桥状结构；感染hPIV-4的细胞，易出现整个单层细胞的改变，细胞肿胀圆化，间隙增大，甚至脱落。
（3）呼吸道合胞病毒：细胞病变的特征是细胞变圆，并发生细胞融合现象。

（4）人偏肺病毒：细胞病变效应在接种后3～23天出现（平均17.3天），大部分病变特征为出现小的、圆的、有颗粒的折射性细胞，偶见合胞体病变。
（5）冠状病毒：SARS-CoV引起的细胞病变明显，细胞变圆、脱落。MERS-CoV引起的细胞病变在酸性条件下表现为细胞融合，在中性或弱碱性条件下表现为细胞变圆和脱落。HCoV-229E、OC43和NL63的病变轻微，细胞呈丝状、颗粒增多、变圆，散在于细胞层上，细胞很少完全破坏。
（6）腺病毒：细胞病变的特点是细胞先变圆，进而成球形，折光性增强，许多病变的细胞聚集成一串串葡萄状。

（二）病毒鉴定与分型

1．免疫学方法 包括经典的中和试验、血凝抑制试验，以及现在仍广泛使用的各种免疫标记技术。该类检测方法的前提是具有病毒相应的抗体，如用针对流感病毒核蛋白或呼吸道合胞病毒融合蛋白的抗体，确定是否为相应病毒，再用特异性抗血清分型或确定特异性抗原类型。

2．基于核酸检测的方法

（1）反转录PCR：越来越多用于病毒的鉴定和分型，可有几种形式：

①实时荧光RT-PCR，使用不同引物和探针，根据是否出现特异性扩增产物进行分型和鉴定。

②常规RT-PCR，使用一条共同引物和互补的分型引物组合，扩增后电泳，根据扩增产物片段的大小，区分不同型别的病毒，如呼吸道合胞病毒G蛋白基因在不同的亚型间高度变异的特点，设计3个引物，P1、P2和P3。

P1根据G蛋白基因5＇端核苷酸的序列设计，该区域A、B亚型间核酸序列高度保守，为A、B亚型的通用引物，P2和P3分别位于核苷酸的3＇端，分别与A亚型和B亚型互补，如果是A亚型，P2和P1共同扩增出277bp的片段，如果是B亚型，则P3与P1扩增出863bp的片段，PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，根据条带的大小，就可以判定A、B亚型。

（2）序列测定：通过序列比对进行鉴定和分型，以及根据系统进化树，研究不同病毒的亲缘关系，随着测序技术的发展，成本降低，该技术将被更广泛应用。

（1）标本毒性反应鉴别与处置：如果在接种标本1～2天内细胞迅速出现老化，这可能是由于标本中含有毒性物质导致的非特异毒性反应，解决的办法是：①将这些接种标本的细胞于-20℃冻融，释放存在的病毒（此为病毒第二代），取0.2ml接种到新的单层细胞上；②如果又出现毒性反应，应该取原始标本用PBS稀释，再次接种到同种细胞中。

（2）污染与对策：细菌污染易造成培养液浑浊或细胞死亡，使感染细胞无法出现细胞病变效应（CPE），或者真菌污染，培养液变酸，细胞无法正常生长，应重新取原始标本接种细胞，并考虑标本是否除菌处理不当，或者操作污染，或者培养液中抗生素浓度不够／失效。支原体污染，细胞形态无明显改变，培养液也不混浊，但细胞的生长特性、细胞膜组成或染色体会出现异常，因此应定期检测细胞是否被支原体污染，一旦被污染，需丢掉被污染的细胞。

（3）避免病毒交叉污染：在倾倒已接种病毒的细胞培养液时，应该用移液管移走液体，每一步都要更换新移液管，避免剧烈震动而产生气溶胶等。

（4）盲传：培养7～10天后仍无细胞病变时，或者其他技术也未显示培养物中有相应病毒的存在，也将培养细胞收获，再接种细胞，盲传3代后，仍无细胞病变，或者其他检测均阴性时，可认为病毒分离阴性。