虫媒病毒的直接检测法

虫媒病毒（ arbovirus）是指一些通过吸血节肢动物叮咬敏感脊椎动物而引起的自然疫源性疾病及人兽共患病的一群病毒，包括不同基因组的许多病毒家族，如黄病毒科（flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）。披膜病毒科（ togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）。布尼亚病毒科（bunyaviridae）、呼肠孤病毒科（reoviridae）以及正黏病毒科（orthomyxoviridae）。作为节肢动物传播的病毒，其共同特征是能在节肢动物体内繁殖，经过一定的外潜伏期，通过叮咬吸血又将病毒传给新的宿主。常见的节肢动物媒介有蚊、蝉、白岭、螺、蛀、纳、螨，尤以蚊和最为重要。鸟类、蝙蝠、灵长类和家畜是最重要的脊椎动物宿主。

显微镜观察的基本原理是电子显微镜可以用来观察病毒的超微结构，所以利用电镜可以根据虫媒病毒的特征将其与其他病毒做出鉴别。

病毒抗原检测的基本原理是登革病毒等虫媒病毒抗原可以从感染病例的外周血中检测到，特别是处于发热期的患者，从相关标本中检测到病毒抗原，说明患者最近感染过该病毒，具有重要的临床意义。检测病毒抗原的方法很多，应用最广泛的是免疫荧光试验（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA ）。

器材：电子显微镜、实时荧光 RT-PCR 仪

1. 显微镜观察﹑电子显微镜可以用来观察病毒的超微结构，所以利用电镜可以根据虫媒病毒的特征将其与其他病毒做出鉴别。

2. 病毒抗原检测登革病毒等虫媒病毒抗原可以从感染病例的外周血中检测到，特别是处于发热期的患者，从相关标本中检测到病毒抗原，说明患者最近感染过该病毒，具有重要的临床意义。检测病毒抗原的方法很多，应用最广泛的是免疫荧光试验（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA ）。

（1）免疫荧光试验：以登革病毒为例，结合登革病毒单克隆抗体的免疫荧光试验是鉴定登革病毒最常用的方法。通常是用登革病毒血清型特异的鼠源单克隆抗体结合组织培养细胞﹑鼠脑、蚊虫或人体组织等待检标本中的登革病毒，并与随后加人的荧光素标记抗鼠 IgG 荧光抗体结合，通过荧光显微镜观察结果。

（2）酶联免疫吸附试验：同样以登革病毒为例，NS1 蛋白是登革病毒的一种非结构糖蛋白，研究表明，无论是初次或再次感染登革病毒，人体内都会出现一种 NS1 抗原的病毒代谢物，NS1 抗原在整个临床症状期间和恢复期的前几天内，血循环中含有高浓度的 NS1 抗原，但抗 NS1-IgG 抗体一旦产生即检测不到。NS1 抗原的出现早于 IgM 抗体，甚至在检测不到登革病毒 RNA 或已有登革病毒 IgM 抗体存在的情况下，也可检测到 NS1 抗原，对登革病毒感染的早期诊断和疫情的早期控制具有重要的意义。

3. 病毒核酸检测目前常用的核酸检测方法为常规反转录 PCR（RT-PCR），巢氏 RT-PCR，实时荧光 RT-PCR 等核酸扩增技术直接检测虫媒病毒的 RNA，这些方法的敏感性及特异性均高于病毒抗原的检测，可用于早期诊断。

（1）常规 RT-PCR

1）设计属内通用引物和种间特异性引物：根据黄病毒属病毒基因的保守性，设计并合成黄病毒属的通用引物和病毒种间特异性引物；或者根据甲病毒属病毒基因的保守性，设计并合成甲病毒属的通用引物和病毒种间特异性引物。

2）提取病毒 RNA：使用 RNA 提取试剂盒或者 Trizol 提取患者血清﹑脑脊液、组织标本和媒介标本的 RNA。

3）RT-PCR 扩增：使用一步 RT-PCR 试剂，对标本的 RNA 进行黄病毒和甲病毒通用引物扩增，同时设立阴性和阳性对照。用琼脂糖凝胶电泳判断扩增片段的大小。若待测样本的黄病毒和甲病毒通用引物扩增结果为阳性，则用病毒种间特异性引物进行虫媒病毒具体种类鉴定，目前常使用乙脑病毒的 PrM 基因、黄热病毒的 NS1 基因、登革病毒的 E 基因、蝉传脑炎病毒的 NS5 基因以及基孔肯雅病毒非结构蛋白区的基因作为靶标用于 RT-PCR 种间和型别特异性鉴定。

4）序列分析：序列测定结果其中一个重要用途是可借助 GenBank 中的海量资源对所测序列进行同源性分析，并以此鉴定未知序列。如广东出入境检验检疫局在发现我国首例输入性基孔肯雅热病例的过程中，就是以 PCR 扩增片段的序列测定分析作为核实鉴定的重要手段。测出的 521 个碱基序列 BLAST 比对结果显示，与基孔肯雅病毒核酸序列的同源性高达 99% ，说明 PCR 扩增产物是基孔肯雅病毒核酸。

（2）实时荧光 RT-PCR：目前，已有公司生产的商品化黄病毒和甲病毒通用核酸实时荧光 PCR 检测试剂盒，也有各类虫媒病毒核酸实时荧光 PCR 检测试剂盒和登革病毒四种血清型分型的试剂盒出售。实验人员也可自行合成虫媒病毒特异性引物和探针，探针用 FAM、VIC、CY5 等荧光进行标记，对待检标本提取的 RNA 进行检测。