常规热不对称 PCR

热不对称 PCR 是传统的引物浓度不对称 PCR 的发展，它利用一对引物的碱基数目与组成不同，造成退火温度的差异而实现。

常规热不对称 PCR 是的基本原理是利用一对引物的碱基数目与组成不同，造成退火温度的差异而实现。设计引物时两引物的退火温度可以根据常用的软件进行分析，也可以根据退火温度的常用计算公式：L = 69.3 + 0.41[（G + C）mol%] — 650/L（L=引物长度）计算，设计的限制性引物与非限制性引物的退火温度应相差 10 °C 以上，其中限制性引物的退火温度低于非限制性引物的退火温度，在最初的 10~15 个循环中使用较低的退火温度（根据限制性引物的退火温度决定，一般略低于限制性引物的退火温度），这时变性后两引物都可以与模板结合，引导 DNA 链的合成，产生双链产物，随后将 PCR 的退火温度提高（根据非限制性引物的退火温度决定），此时限制性引物不能再与模板发生退火，只有非限制性引物可以与模板结合后继续引导扩增，从而产生大量单链 DN。其具体过程如图 6-2 所示。

器材：

① PCR 仪；

② 电泳仪等。

试剂：

① 合成的寡核苷酸引物；

② 模板 DNA；

③ 4 种 dNTP；

④ Taq DNA 聚合酶。

常规热不对称 PCR 的基本过程可分为如下几步：

热不对称 PCR 的反应体系与常规 PCR 相同，总体积 100/μL 反应体系含有：

A. 94 °C , 预变性 1~2 min，随后进行第一个阶段 10 个循环，每一循环 94 °C 1 min，50 °C 1 min，72 °C 1 min。

B. 然后紧接着进行第二阶段的 20 个循环，每一次 94 °C 1 min，70 °C 1 min，72 °C 1 min，循环结束后 72 °C 延伸 7 min。

C. PCR 结束用 1% 的琼脂糖凝胶电泳常规分析产物。